01:39
Comentarii Adauga Comentariu

Analiza cantitativă arată modul în care activarea și reglarea EGFR e cuplată în celulele normale, dar nu în celulele canceroase



Articolul | Deschideți | Publicat:

Analiza cantitativă arată modul în care activarea și reglarea RFCE sunt cuplate în celulele normale, dar nu în celulele canceroase

Natura Comunicații Volumul 6 , numărul de articol: 7999 (2015) | Descărcați Citare

AbstractAbstract

Ubiquitinizarea receptorului factorului de creștere epidermal (EGFR) care apare atunci când Cbl și Grb2 se leagă la trei resturi de fosfotirozină (pY1045, pY1068 și pY1086) pe receptor prezintă un efect de prag ascuțit ca o funcție a concentrației EGF. Aici folosim o abordare simplă de modelare împreună cu experimente pentru a demonstra că stabilirea pragului necesită atât multitudinea de situsuri de legare, cât și legarea în comun a Cbl și Grb2 la EGFR. În timp ce pragul este remarcabil de robust, un model mai sofisticat a prezis că ar putea fi modulat ca o funcție a nivelurilor RFCE pe suprafața celulei. Am confirmat experimental că sistemul a evoluat pentru a se realiza în mod optim la niveluri fiziologice ale EGFR. În consecință,

IntroducereIntroducere

După implicarea ligandului (liganzilor) înrudit, receptorul factorului de creștere epidermal (EGFR) formează dimeri capabili de autofosforilare și de fosforilare a altor proteine 1 , 2 . După dimerizarea EGFR, domeniul tirozin kinazei unui fragment EGFR fosforilează mai multe resturi Tyr în fragmentul partener 3 . Domeniul extracelular al EGFR poate adopta două conformații, închise și extinse 4 , acesta din urmă fiind competent pentru dimerizare 5 , 6 . Legarea EGF stabilizează forma extinsă, favorizând astfel formarea dimerilor și permite domeniului kinazei EGFR să atingă substraturile Tyr 7 , 8 , 9 , 10, 11 . Activitatea kinazei este contrastantă de fosfatază care acționează la membrana deja în stadiile foarte timpurii ale semnalizării EGFR 12 , 13 , 14 , 15 .

Moleculele care conțin module care leagă fosfotroizinele EGFR (pY) sunt recrutați la membrana plasmatică (PM) și activează căile de semnalizare care conduc la ieșiri biologice dependente de context 1 , 2 . O astfel de moleculă este ligatura de ubiquitin Cbl, care se leagă la EGFR printr-un mecanism mediat de pY și ubiquitinates receptorul 16 . Ubiquitinizarea EGFR este critică pentru traficul receptorilor prin compartimentele endosomale / lizozomale 17 , 18 , 19 și pentru etapa de internalizare la PM 20 , 21 , 22 .

Am arătat recent că curbele doză-răspuns pentru fosforilarea EGFR Tyr și afișare ubiquitinarea grade diferite de sigmoidicity, cel mai bine aproximate prin funcții Hill cu coeficienții Hill ( n H ) de 1 și 3, respectiv (vezi Fig. 1a pentru o schemă a interacțiunea dintre fosforilare și ubicuitare) 21 . În cazul ubiquitinării, curba doză-răspuns are un prag între 1 și 10 ng ml -1 de EGF în celulele HeLa. Acest prag de ubiquitinizare este o caracteristică biologică importantă deoarece controlează modalitatea de internalizare a EGFR la PM și permite astfel celulelor să traducă intrările cantitative (concentrațiile EGF) în mecanisme de internalizare calitativ diferite 21, 23 . La concentrații scăzute de EGF (≤1 ng ml -1 ), EGFR este aproape ubicitinat și internalizat în principal prin endocitoză mediată de clathrin (CME). La concentrații ridicate de EGF (> 10 ng ml -1 ), o fracție semnificativă a EGFR este endocitozată printr-o cale independentă de clathrin (endocytoză nonclathrin, NCE), deoarece receptorul devine ubiquitinat. CME și NCE sunt asociate în mod predominant, deși nu exclusiv cu (i) reciclarea EGFR la PM și menținerea semnalizării, în cazul CME și (ii) degradarea EGFR și atenuarea semnalului, în cazul NCE 21 . Astfel, pragul de ubiquitinizare controlează soarta receptorului și echilibrul între întreținere și atenuarea semnalizării RFCE.

Figura 1: Curbele doză-răspuns ale fosforilării EGFR.
figura 1

( a ) Reprezentarea schematică a ubiquitinării EGFR (Ub) și a fosforilării totale a Tyr EGFR (pY tot). x T reprezintă concentrația semi-maximală de EGF pentru ubiquitinizarea EGFR (adică pragul de ubiquitinizare). Concentrația EGF este exprimată în au ( b ) Reprezentarea schematică a situsurilor de fosforilare Tyr în coada citoplasmatică a EGFR-WT (stânga) și a mutantelor adiționale (1045+, 1068/86 +, 3Y +), unele dintre acestea fiind utilizate în c - f. Se prezintă domeniul intracelular incluzând domeniul kinazei (roșu) și coada C-terminală (linia neagră) a EGFR. Este prezentată poziția celor nouă reziduuri Tyr fosforilatabile. Reziduurile Tyr implicate în legarea Cbl / Grb2 și ubiquitinarea EGFR ulterioară sunt indicate în albastru, în timp ce celelalte resturi Tyr sunt reprezentate în negru. Fosforilarea lui Y1045 ( c ) sau a Y1068 ( d ) în EGFR-WT sau mutanții indicați de back-back. Punctele experimentale sunt luate din ref. 21 . Fosforilarea este reprezentată grafic, pentru fiecare condiție, normalizată la valoarea maximă pY obținută în această stare (pY / pY MAX ). (de exemplu,) Curbele de fosforilare determinate experimental pentru doza-răspuns pentru EGFR-WT și EGFR-3Y +. Punctele experimentale sunt luate din ref. 21 . Estimarea fosforilării EGFR este exprimată pentru fiecare condiție, normalizată la valoarea maximă obținută în această stare (pY / pY MAX ). ( f ) Raportul experimental dintre fosforilarea totală Tyr (pY tot) a EGFR-WT și EGFR-3Y + după 2 min de stimulare cu concentrațiile indicate de EGF. Datele sunt derivate din analiza densitometrică a IB din trei experimente independente ± sd (a se vedea figura suplimentară 1 pentru reprezentantul IB). În ( c - f ) EGFR-WT și mutanții au fost exprimați în fibroblaste NR6, care nu au EGFR 21 endogen .

Un indiciu în sensul înțelegerii pragului de ubicuitate este faptul că fosforilarea și ubicitinația sunt legate cauzal. Pentru a ubiquitinate EGFR, Cbl trebuie să se lege de receptor. Legarea apare fie direct, prin intermediul unui modul de legare pY conținut în Cbl care se leagă la pY1045 al EGFR, fie indirect, prin legarea unui complex Grb2: Cbl la fie pY1068 sau pY1086, prin domeniul SH2 al lui Grb2 (ref 16 , 24 , 25 , 26 ). În mod critic, Y1045, Y1068 și Y1086 sunt nu numai necesare, ci și suficiente pentru ubiquitinizarea EGFR, ca mutant EGFR care transportă numai aceste trei resturi Tyr (EGFR-3Y +) și nici unul din celelalte resturi Tyr fosforilatabile (vezi Fig.1bpentru o schemă a situsurilor de fosforilare EGFR), prezintă o curbă de răspuns la doză-răspuns ubicuitină care nu poate fi diferențiată de EGFR-WT ( 21 de tip sălbatic) . În schimb, ubiquitinizarea unui mutant EGFR (EGFR-Y1045 +) care conține numai reziduul Tyr fosforilatabil responsabil pentru legarea directă Cbl (Y1045) nu prezintă un prag și este semnificativ redus comparativ cu EGFR-WT ( ~ 80% reducere) 21 .

Aici luăm în considerare toate aceste date care oferă o descriere la nivel de sistem a mecanismelor care contribuie la crearea pragului și care determină în consecință răspunsul celular (întreținere versus atenuarea semnalizării) la diferite concentrații ale FEG. Am profitat de numeroasele modele existente ale activării EGFR și semnalizare 12 , 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , luând în același timp în considerare componenta ubiquitination a sistemului care a primit până în prezent o atenție rare 35 .

RezultateRezultate

Modelul de Phoshorylation multisite (MPM)

Am dezvoltat inițial un model simplu care să țină seama de fosforilarea EGFR la 2 minute de stimulare EGF, când fosforilarea și ubicitinarea au loc predominant la PM 21 .

Am demonstrat anterior că curbele doză-răspuns ale fosforilării reziduurilor Tyr individuale 21 urmăresc același comportament hiperbolic ca cel al fosforilării globale EGFR Tyr ( n H ≈ 1) (ref. 21 ). Mai mult, la 2 min de stimulare EGF, resturile Tyr individuale sunt fosforilate independent una de cealaltă, deoarece curbele lor de răspuns la doză-răspuns ale fosforilării nu se modifică în prezența (EGFR-WT) sau absența (mutanți Tyr, Figura 1b ) situsurile de fosforilare ( Fig. 1 c, d , punctele experimentale sunt luate din ref. 21). Consecvent, am observat că normalizate curbele doză-răspuns ale EGFR-WT și EGFR-3Y + fosforilare au fost nediferențiabili, atât în termeni de jumătate din doza maximă (pY 0,5 ) și prăvăliș n H ( fig. 1e , punctele experimentale sunt luate din ref . 21 ). Mai mult decât atât, în termeni absoluți, fosforilarea Tyr a EGFR-WT (care transportă nouă Tyr fosforilatabile) a fost de aproximativ trei ori mai mare decât cea a EGFR-3Y + (cu trei Tyr fosforilatabile Fig.1f și Fig . Fosfatazele contribuie, de asemenea, la fosforilarea netă a EGFR, deoarece acestea sunt cunoscute a fi active deja în stadiile incipiente ale semnalizării EGFR 12 , 13 ,14 , 15 , 36 .

Aceste date sugerează un model simplu pentru fosforilarea timpurie a EGFR (modelul de fosforilare multisită sau MPM). În ceea ce privește reacțiile elementare, reziduurile Tyr individuale sunt fosforilate independent unul de altul atunci când nu concurează pentru domeniul kinazei: acest lucru poate apărea dacă complexul kinază: Tyr este instabil ( figura 2a ). În cadrul acestui scenariu, etapa de limitare a vitezei este kinaza: legarea Tyr și se așteaptă ca kinaza să fie mai mult liberă (enzimă liberă). Același lucru se aplică fosfatazelor, a căror activitate la 2 minute după stimularea EGF a fost recent măsurată 12 și pusă în aplicare în modelele noastre.

Figura 2: Modelarea fosforilării EGFR: regimul kinazei libere reprezintă curbele experimentale de fosforilare.
Figura 2

( a ) Reprezentarea schematică a reacțiilor enzimatice care conduc la fosforilarea EGFR într-un dimer activ. Top, reacția Michaelis-Menten, prin care domeniul tirozin kinazei (TK) al unui EGFR se leagă invers la coada C-terminală a unui EGFR partener cu constantele ratei de legare / deconectare k on și respectiv k off . După adăugarea unei grupări fosfat, TK disociază de substrat cu constantă viteză k cat . Bottom, schema de reacție simplificată pentru Tyr fosforilare se caracterizează prin k KIN . ( b) Pot fi identificate două regimuri de limitare (libere și saturate) pentru reacția catalizată de kinaze, în funcție de stabilitatea complexului dintre subunitatea catalitică a EGFR și substratul său Tyr. Curbele reprezintă media a 10 5 cicluri ale algoritmului stocastic Gillespie 62 aplicat la schema standard de reacție Michaelis-Menten descris într - o ( a se vedea nota complementară 1 pentru detalii). ( c) Schema de conectare a MPM. În partea de sus, fosforilarea resturilor Tyr individuale (cercuri albastre) are loc independent de fosforilarea celorlalte resturi Tyr. Aceasta are ca rezultat o diagramă de conectare ramificată, în care fiecare eveniment de fosforilare are loc cu aceeași probabilitate. În partea de jos, moleculele EGFR (cercuri roșii) cu același număr total de grupări fosforil (cercuri albastre) sunt grupate pentru a genera un lanț liniar de EGFR din ce în ce mai mult fosforilați. Sunt prezentate numai cele trei reziduuri Tyr relevante pentru ubiquitinizarea EGFR (adică Y1045, Y1068, Y1086). și sunt ratele de adunare și scădere a unui grup de fosforil dintr - o moleculă EGFR care transportă alfa resturile Tyr -phosphorylated. ( d) O comparație a fosforilării EGFR-WT și -3Y + calculată de MPM în regimul kinazei libere / fosfatazei libere în funcție de EGF (model, liniile solide) sau determinată experimental (exp, linii punctate: datele obținute din Fig. 1e ). EGFR fosforilarea a fost normalizată la valoarea maximă pY (pY / pYmax). ( e ) O comparație a raportului pY total al EGFR-WT și EGFR-3Y +, funcție de concentrația EGF (la 2 min), calculată prin MPM (linia întreruptă) sau determinată experimental (linie solidă, date luate de la Figura 1f , a se vedea și figura suplimentară 1 ).

Simulările unui receptor compuse din nouă reziduuri Tyr identice confirmă faptul că, dacă kinazele (sau fosfatazele, înlocuind Tyr cu Tyr fosforilat) funcționează sub regimul enzimelor libere, fiecare Tyr contribuie în același mod la rata de fosforilare EGFR. Acest lucru este valabil indiferent de numărul de site-uri disponibile. În consecință, rata de fosforilare EGFR scade liniar cu numărul de reziduuri Tyr disponibile pentru fosforilare ( figura 2b , linie solidă neagră). Într-un regim alternativ, în care kinaza este mai mult legată de substrat (regim saturat), rata de fosforilare a EGFR nu se modifică odată cu numărul de reziduuri Tyr ne-fosforilate ( Figura 2c, linia întreruptă albastră). În acest caz, nouă reziduuri de Tyr fosforilatabile sunt fosforilate la aceeași rată ca numai una, ceea ce înseamnă că rata de fosforilare pe reziduu Tyr scade cu numărul de situri disponibile. Prin urmare, am ales pentru modelul nostru regimul de enzime libere atât pentru kinaze, cât și pentru fosfataze.

Ca rezultat, în modelul MPM, constanta vitezei de fosforilare EGFR crește odată cu numărul de reziduuri Tyr ( Nota complementară 1 ). În ceea ce privește cinetica enzimatică, putem atribui numai o singură constantă a vitezei de fosforilare fiecărui rest Tyr independent de starea de fosforilare a receptorului ( figura 2c , panoul superior). Este important faptul că aceste rezultate permit monitorizarea stării de fosforilare a oricărui rest Tyr individual, fără a ține seama de celelalte.

Pentru a reduce în continuare numărul de variabile, am introdus o simplificare în MPM utilizând aceleași constante de viteză pentru fiecare Tyr ( k KIN și k PTP pentru reacțiile catalizate de kinaze și fosfataze, respectiv). Acest lucru ne -a permis să grupeze receptori cu un număr egal de Pys (adică, EGFR nefosforilată (R 0 ), 1pY-EGFR (R 1 ), 2 PY-EGFR (R 2 ) și așa mai departe) , indiferent de identitatea specifică a pY ( figura 2c , panou inferior). Această simplificare este justificată prin observarea faptului că diferitele situsuri pY au cinetică de fosforilare similară în primele 2 minute ale simulării 37 a FEG. Mai mult decât atât, am arătat că comportamentul MPM nu diferă calitativ dacă diferențiem ratele de fosforilare pentru Y1068 / 86 și Y1045 ( figura suplimentară 2 ). În această schemă, starea de fosforilare a EGFR este atribuită pe bază probabilistică.

Pentru a compara MPM cu date experimentale, este necesar să definim relația dintre fosforilarea EGFR și concentrația EGF. Pentru a menține modelul simplu, inițial am ignorat numeroasele reacții care contribuie la activarea EGFR, care vor fi incluse într-un model mai complex, Modelul de activare timpurie (EAM, vezi mai jos). În schimb, am folosit o lege fenomenologică pentru a lega fosforilarea EGFR și concentrația EGF. Mai precis, am folosit funcția Hill, prin care am fixat curbele experimentale doză-răspuns ale EGFR-WT și ale mutantului EGFR-3Y + pentru a identifica n și J ( Nota complementară 1 ).

După montare, MPM a reprodus curba doză-răspuns a fosforilării EGFR. Deoarece am folosit regimul liber pentru fosforilarea EGFR, rezultatul este independent de numărul de resturi Tyr atunci când curbele sunt normalizate la valoarea lor maximă ( Figura 2d ). Mai mult decât atât, modelul a atribuit corect o creștere triplă fosforilării totale Tyr a EGFR-WT în comparație cu fosforilarea totală Tyr a mutantului EGFR-3Y +, pentru fiecare valoare a EGF ( Fig.2e și Fig .

În concluzie, am dezvoltat un model, MPM, care reproduce cu fidelitate distribuția speciilor fosforilate EGFR, ca funcție a concentrației EGF, la 2 minute de stimulare.

Modelarea ubiquitinării RFCE

Apoi am adăugat la MPM procesele care duc la ubiquitinizarea RFCE. Studiile asupra funcției structurale cu fosfomutanți EGFR au demonstrat că legarea Cbl este necesară și suficientă pentru ubiquitinizarea EGFR și că dependența dozei EGF de asocierea Cbl: EGFR in vivo prezintă un profil asemănător pragului, foarte similar cu ubiquitinizarea 21 a EGFR . Pentru a descrie dinamica ubicitării EGFR, am limitat analiza noastră la dinamica interacțiunii Cbl: EGFR și am presupus că ubiquitinizarea este pur și simplu proporțională cu cantitatea de EGFR legată de Cbl (Ecuația 15 din Nota complementară 1 ).

Analiza experimentală a legării Cbl la EGFR a sugerat că interacțiunea dintre EGFR și Cbl este cooperativă cu legarea lui Grb2 la receptorul 21 . Într-adevăr, dacă legarea Cbl (în complex cu Grb2) la EGFR ar avea loc cu aceeași afinitate ( k on / k off ), indiferent de legarea lui Grb2, atunci EGFR-WT și EGFR-Y1045 + ar trebui să lege o cantitate similară din Cbl. Cu toate acestea, am stabilit anterior că legarea Cbl la EGFR, precum și ubiquitinizarea EGFR, sunt reduse puternic în mutantul EGFR-Y1045 + și absente sau neglijabile în mutantul EGFR-Y1068 / 86 + 21 . În contrast, legarea Cbl și ubiquitinizarea EGFR sunt indistinguizabile în EGFR-WT și în mutantul EGFR-3Y + 21.

O explicație plauzibilă pentru cooperativitate este că atunci când Cbl și Grb2 sunt simultan legați de EGFR (prin pY1045 și pY1068 / pY1086, respectiv), aceștia se află într-o stare de proximitate forțată, ceea ce crește probabilitatea celor trei specii (EGFR, Cbl și Grb2 ) de legare reciprocă 38 . În modelul nostru, am tradus prezența cooperativității după cum urmează: Cbl și Grb2 pot forma un complex care se leagă de pYs corespunzător EGFR; ele pot de asemenea să lege RFCE în mod individual. Cu toate acestea, ratele de legare Cbl și Grb2 (în raport cu celelalte și cu EGFR) sunt crescute în complexul multimeric ( Fig.3a). Presupunând că cooperativitatea forțată de proximitate conduce, am afirmat că afinitatea de legare a EGFR și Cbl crește proporțional cu creșterea locală a concentrațiilor de Grb2 și Cbl asupra receptorului ( Nota complementară 1 ).

Figura 3: Cbl este limitarea pentru ubiquitinizarea EGFR.
Figura 3

( a ) Reacțiile implicate în ubiquitinizarea RFCE. (1) Cbl se leagă de pY1045 indiferent dacă este liber sau într-un complex cu Grb2 (Grb2 este astfel reprezentat cu o linie punctată); (2) Grb2 se leagă de pY1068 (sau pY1086, nereprezentat în schemă) indiferent dacă acesta este liber sau într-un complex cu Cbl (reprezentat cu o linie punctată); (3) Cbl și Grb2 se leagă unele de altele; (4) dacă complexul Cbl / Grb2 se leagă la EGFR prin reacția (1), legarea descrisă de (2) are loc printr-o reacție de prim ordin ( Nota complementară 1, Eq. (8)). În mod similar, dacă legarea inițială are loc prin reacția (2), reacția (1) care urmează va fi prima ordine. Reacția (3) poate de asemenea să devină prima ordine, dacă este precedată de reacția (1) doar pentru Cbl și prin reacția (2) numai pentru Grb2 (nu este prezentat). Conform ipotezei cooperative, sunt favorizate reacțiile de prim ordin (săgeți groase). ( b ) Cuantificarea moleculelor Grb2 și Cbl în celulele HeLa. Panourile 1, 2, 3: cantități crescătoare de lizat de celule HeLa au fost supuse la IB și IP așa cum s-a indicat și s-au comparat cu cantități crescătoare de proteine ​​Grb2 (1) sau Cbl (2,3) purificate in vitro , așa cum este descris în Metode. Bottom: tabel care indică numărul de jucători critici implicați în reacția de ubiquitinizare a EGFR în celulele HeLa. Numărul de molecule de suprafață EGFR a fost măsurat prin125 Legarea saturației I-EGF (vezi Metodele). Datele sunt exprimate ca număr de EGFR de suprafață per celulă. Rezultatele medii, calculate din cel puțin trei experimente independente ± sem, sunt afișate. ( c ) În partea superioară, celulele HeLa, transfectate cu vectorul gol (Vector), WT Cbl (supraexprimare, OE) sau mutantul Cbl70Z, au fost tratați cu EGF la concentrațiile indicate timp de 2 minute. Lizatele au fost IP și IB așa cum se arată (a se vedea, de asemenea, figura suplimentară 3a ). Dozare, cuantificarea efectului exprimării Cbl OE sau Cbl70Z asupra ubiquitinării EGFR prin analiza densitometrică a IB, așa cum se arată în panoul superior, din trei experimente independente. Ubiquitinizarea EGFR este exprimată, pentru fiecare condiție, normalizată la valoarea maximă obținută în controlul vectorului gol (Ub / Ub WT ).

Apoi am determinat experimental cantitățile totale de Cbl, Grb2 și EGFR în celule HeLa. Nivelurile de suprafață ale EGFR, măsurate prin legarea de saturație, au fost calculate a fi de ~ 300.000 molecule pe celulă ( Figura 3b ). De asemenea, am estimat că Grb2 este prezent la aproximativ 1.000.000 de molecule per celulă ( Figura 3b ). Foarte important, am arătat anterior că fracțiile Grb2 ca singură specie monomerică în coloanele de dimensionare 21 , indicând faptul că majoritatea moleculelor Grb2 sunt fie libere, fie formează complexe foarte instabile. Prin urmare, în modelul nostru, am presupus că toate Grb2 măsurate sunt disponibile pentru legarea la EGFR și / sau la Cbl.

În ceea ce privește Cbl, acesta este exprimat în celule HeLa la aproximativ 150.000 de molecule pe celulă ( Figura 3b ). Cu toate acestea, am arătat anterior, utilizând cromatografia de excludere a mărimii, că majoritatea Cbl este implicată în complexe stabile 21 , compatibile cu noțiunea că Cbl se leagă la> 100 proteine ​​diferite 39 . Acest rezultat sugerează că doar o mică parte din Cbl (în formă liberă sau angajată în complexe Cbl: Grb2) este disponibilă pentru legarea directă cu EGFR. În model, am folosit Cbl (Cbl-pY) fosforilat ca proxy pentru cantitatea maximă de Cbl disponibilă pentru legarea la EGFR, deoarece (i) Cbl este fosforilat la legarea la EGFR și (ii) doar Cbl fosforilat este competent pentru ubiquitinizarea EGFR 16 , 40, 41 . Cantitatea de Cbl-pY a fost determinată experimental ca ~ 5000 de molecule pe celulă după stimularea cu EGF (100 ng ml- 1 ) timp de 2 minute ( Figura 3b ).

Rezultatele de mai sus indică faptul că Cbl, în comparație cu EGFR și Grb2, este limitarea vitezei în reacția de ubiquitinizare a EGFR. În consecință, supraexpresia modulativă-ascendentă sau descendentă și expresia mutantului dominant-negativ Cbl70Z, respectiv, produce modificări congruente în nivelurile de ubiquitinizare a EGFR ( Fig.3c ). Am concluzionat că Cbl este limitator de viteză în procesul de ubiquitinizare a EGFR.

MPM-B: un model de ubiquitinizare a RFCE

Apoi, am folosit MPM ca intrare pentru legarea Cbl și Grb2 pentru a obține un model de ubiquitinizare EGFR, MPM-B (MPM plus Binding, a se vedea Nota complementară 1 ). Concentrațiile de Cbl și Grb2 au fost stabilite în conformitate cu măsurătorile descrise mai sus. Ratele de legare pentru Cbl și Grb2, pentru care nu avem valori experimentale, au fost identificate prin montarea: (i) curbelor de răspuns la doză-răspuns pentru ubiquitinizare pentru mutanții 3Y + și 1045+ și (ii) experimentele modulate Cbl descrise în secțiunea precedentă ( figura 3c ).

Am calculat modelul presupunând că toate speciile sunt la starea de echilibru în absența FEG; la momentul zero am introdus EGF în sistem și am calculat valorile fiecărei specii după 2 min. MPM-B a reprodus, în detaliu cantitativ, creșterea abrupței curbei de ubicuitate față de curba de fosforilare pentru EGFR-WT, așa cum este arătat de curbele normalizate, precum și de raportul lor ( fig.4a stânga și inset, respectiv). Modelul a reprodus, de asemenea, scăderea abrupței curbei de ubicuitate a EGFR-Y1045 + ( fig.4a dreapta și inset), deși mai puțin precis decât WT. În cele din urmă, MPM-B a reprodus curba doză-răspuns pentru ubiquitinizare în toate condițiile expresiei Cbl ( Figura 4b, stânga). În acest caz, modelul a sugerat că creșterea de șapte ori a expresiei Cbl, obținută experimental ( Fig. 3a complementară ), nu conduce la o creștere de șapte ori a Cbl disponibilă pentru legarea EGFR. Mai degrabă, modelul sugerează că aproximativ 1/3 din moleculele supraexprimate sunt capabile de legarea receptorilor.

Figura 4: MPM-B reproduce curbele EGFR de fosforilare și ubiquitinizare doză-răspuns.
Figura 4

( a ) Compararea curbelor doză-răspuns pentru liniile experimentale (linii punctate) și fosforilarea (pY) și ubiquitinizare (Ub) pentru EGFR-WT (stânga) și EGFR-Y1045 +. Rețineți că curbele modelate sunt pentru EGFR-3Y +, deoarece se comportă ca EGFR-WT când sunt normalizate la valoarea maximă ( Fig.1e ). Datele experimentale sunt exprimate pentru fiecare condiție normalizată la valoarea maximă pentru această condiție; simulările sunt normalizate la maxime optimizate (a se vedea tabelul suplimentar 1). Inserția prezintă raportul de ubiquitinizare cu fosforilarea ca funcție a concentrației EGF pentru datele experimentale și modelate. Simulările au fost efectuate cu MPM-B în panoul din stânga și o versiune modificată a MPM-B unde am stabilit la zero toate reacțiile care duc la fosforilarea situsului Y1068, în panoul din dreapta. În ambele panouri, s-au obținut date din analiza densitometrică a IB-urilor prezentate în figura suplimentară 1 și ref. 21 . Rezultatele medii, calculate din cel puțin trei experimente independente, sunt afișate. Barele de eroare din grafice reprezintă sem ( b ) Compararea curbelor de răspunsuri la doză-răspuns ale ubiquitinării EGFR (linii întrerube) și modelate (liniile solide) în condiții de modulare Cbl. Datele experimentale au fost luate din figura 3c. Cbl OE și downregulation (Cbl 70Z) au fost modelate ca o creștere și scădere de două ori în MPM-B, respectiv. Datele sunt exprimate, pentru fiecare condiție, normalizate la valoarea maximă în controlul vectorului gol (Ub / Ub WT , stânga) sau la propriul maxim (Ub / Ub MAX , dreapta). Barele de eroare de pe parcele reprezintă forma sem calculată cel puțin trei experimente independente.

Interesant, modelul a arătat de asemenea că modularea nivelurilor Cbl (în limita unei limite), în ciuda afectării cantității de ubiquitinizare EGFR ( Fig. 3b, c ), nu afectează pragul de ubiquitinizare, observat experimental ( Fig.4b , dreapta) . Această lipsă de efect asupra pragului nu este imediat evidentă, având în vedere modificările considerabile ale ubiquitinării totale a EGFR la modulul Cbl ( figura 4b , stânga). Este important faptul că această condiție este verificată de model numai dacă numărul de molecule Cbl disponibile pentru legarea EGFR nu depășește ≈5000 Cbl molecule pe celulă în condiții bazale ( Figura complementară 3b). În mod evident, acest număr este în concordanță cu numărul maxim de molecule active Cbl (Cbl-pY) per celula pe care le-am estimat experimental ( Figura 3b ).

În final, am efectuat o analiză de robustețe și am observat că modelul este robust pentru modificarea valorilor parametrilor în ceea ce privește atât poziția pragului, cât și forma curbelor de ubiquitinizare și fosforilare a dozei-răspuns ( figura 4a, b ). În concluzie, MPM-B reproduce în mod robust comportamentul pragului de ubicuitate.

Cooperativitatea ajută la stabilirea pragului de ubicuitate

Am folosit MPM-B pentru a investiga in silico rolul potențial al cooperativității între Cbl, Grb2 și EGFR în stabilirea pragului de ubicuitate EGFR. Dat fiind faptul că un model probabilistic al fosforilării stă la baza MPM și MPM-B, nu este surprinzător faptul că prezența ambelor situsuri de legare Cbl (pY1045 și pY1068 / pY1086) este necesară pentru prag. Într-adevăr, ubiquitinizarea EGFR-Y1045 +, care necesită doar un pY pentru a fi ubiquitinată, nu prezintă un prag. Interesant, dacă simulăm un model alternativ, noncooperativ (Eq. (9) din Nota complementară 1 ), efectul de prag se pierde și în EGFR-3Y + ( Fig.5a). Prin urmare, această analiză sugerează că ipoteza probabilistică este necesară, dar nu suficientă pentru a ține cont de pragul, care necesită și mecanismul de cooperativitate prezentat în figura 3a .

Figura 5: Cooperativitatea este necesară pentru a genera pragul de ubiquitinizare a RFCE.
Figura 5

( a ) Efectul simulărilor cu un model MPM-B cooperativ versus noncooperator pe pragul de ubiquitinizare EGFR-3Y +. În modelul cooperativ, prezența proximității forțate a Cbl, Grb2 și EGFR (cooperativă, linia roșie) crește înălțimea ubicitării în comparație cu fosforilarea (linia solidă neagră). În regimul noncooperator, fosforilarea și ubicitinarea au aceeași acuitate. Simulările modelului necooperator (linia întreruptă albastră) au fost efectuate cu MPM-B, cu excepția faptului că parametrii kb45 * , kb68 * și kbcg * (a se vedea figura 3a pentru definițiile simbolurilor) au fost reduse prin setarea fLOC = 1, Notă suplimentară 2, astfel încât condițiile kb45 * >> kb45 × [Cbl], kb68 * >> kb68 × [Grb2] și kbcg * >> kbcg × [Grb2] nu mai sunt verificate. ( b ) Distribuția liniilor singulare (1-B, linii negre) și dublu (2-B, linii roșii) leagă modificările complecșilor EGFR-Cbl în prezența (cooperativă, liniile solide) sau absența mecanism de proximitate forțată. Au fost realizate simulări ca și în a .

Relevanța cooperativității a devenit evidentă atunci când am comparat simulările modelelor cooperative și necooperatorii, în ceea ce privește modul în care Cbl este legat de EGFR: prin pY1045 numai (legat individual) sau prin pY1045 și pY1068 / pY1086 prin Grb2 (dublu legat). Numai în modelul de cooperare, specia singulară legată este aproape complet transformată în Cbl dublu legat atunci când concentrația EGF crește peste prag ( Figura 5b ). Am concluzionat că mecanismul de cooperare este necesar pentru formarea pragului de ubicuitate.

Model de activare timpurie (EAM)

Am folosit MPM-B pentru a înțelege modul în care poate fi modulat pragul de ubiquitinizare EGFR. Pentru a identifica parametrii care pot modifica poziția pragului, am împărțit sau înmulțit cu un ordin de mărime toți parametrii modelului și am derivat, pentru pragul de ubiquitinizare EGFR x T , un "parametru de sensibilitate" normalizat pentru perturbații mari de fiecare parametru k j , . Atunci când este mai mare de 1, sistemul răspunde cu o modificare mai mare decât variația parametrului. În astfel de cazuri, parametrul este astfel identificat ca un bun candidat pentru verificarea experimentală. Analiza a identificat un singur parametru, rata de fosforilare EGFR k KIN (Figura 5 ), care poate fi modulate greu experimental.

Pentru a identifica mai multe ținte posibile în model, am înlocuit funcția Hill utilizată pentru a cupla nivelele EGF și activitatea EGFR cu detaliile moleculare ale activării EGFR. EAM, spre deosebire de MPM și MPM-B, include, de asemenea, deschiderea și închiderea EGFR, legarea EGF la EGFR și dimerizarea receptorului ( Figura 6 suplimentară ). Pentru a aborda aceste reacții suplimentare, am pornit de la modelele propuse anterior 34 , 42 . În ceea ce privește relația dintre activarea EGFR și fosforilare, pe baza studiilor structurale ale EGFR 5 , 6 , 7 , 9 , 10 , 11, am presupus că un fragment EGFR poate fosforila partenerul său numai atunci când este într-un dimer și legat de EGF. Evident, EAM ( Figura 6a și Nota complementară 1 ) are mai mulți parametri decât MPM-B; pentru multe dintre acestea, putem defini o gamă rezonabilă de valori, datorită cantității mari de date experimentale și de modelare disponibile în literatură ( tabelul suplimentar 1 , tabelul suplimentar 2 și nota complementară 2 ).

Figura 6: EAM reproduce curbele fosforilării și ubiquitinării RFCE.
Figura 6

( a) Schema de conectare a EAM pentru un EGFR cu trei Tyr fosforilatabile. Pentru a reduce complexitatea modelului, nu am introdus explicit dimeri; totuși, cu o schimbare a variabilelor, le-am urmărit ca molecule individuale EGFR care pot fi fie monomere, fie dimerice. Astfel, EGFR într-un dimer poate fi fie competent pentru fosforilare și, prin urmare, activare sau nu, în funcție de faptul că EGFR partener este legat de EGF. Fiecare specie chimică reprezintă o singură porțiune de EGFR care poate fi fie un monomer (cercuri și ovale), fie unul dintre cei doi membri ai unui dimer (pătrate). Partidele EGFR se caracterizează prin atribute diferite: (i) prezența (negru) sau absența (gri) a ligandului; (ii) conformație închisă (ovală) sau extinsă (cerc); (iii) numărul de pYs (circular P). Partidele EGFR în dimeri pot fi inactive (pot fi defosforilate, albastru) sau activă (poate fi fosforilată sau defosforilată, roșie). Deschiderea / închiderea și fosforilarea / defosforilarea urmează cineticii de ordinul întâi, în timp ce legarea EGF (EGF nu este prezentată explicit) și tranziția de la monomer la dimer sunt reacții de ordinul doi. Cinetica acestei ultime reacții este proporțională cu concentrația tuturor speciilor care participă la dimerizare. (b ) Compararea curbelor experimentale (linii punctate) și a modelelor (liniilor solide) pentru fosforilarea și ubiquitinizarea curbelor doză-răspuns pentru EGFR-WT. Rețineți că curbele modelate sunt pentru EGFR-3Y +, deoarece se comportă ca EGFR-WT când sunt normalizate la valoarea maximă ( Fig.1e ). Inserția prezintă raportul de ubiquitinizare cu fosforilarea ca funcție a concentrației EGF pentru datele experimentale și modelate. Datele experimentale sunt aceleași cu cele prezentate în figura 4a la stânga și au fost normalizate pentru valoarea maximă pentru această condiție. Simulările sunt normalizate la maxime optimizate (a se vedea tabelul suplimentar 1 ). ( c , d ) Analiza sensibilității. Am variat fiecare parametru cu 1% și am calculat coeficientul de sensibilitate σpentru coeficientul Hill n H ( c ) și pentru ambele fosforilare jumătate de maxim nivelul pY 0.5 și pragul de ubiquitination x T ( d ), pentru fosforilarea EGFR (albastru) și ubiquitinarea (roșu). A se vedea nota complementară 3 .

Când am montat curbele doză-răspuns pentru fosforilarea și ubiquitinizarea EGFR cu modelul EAM, am obținut rezultate foarte asemănătoare cu cele obținute cu MPM-B ( Figura 6b ). De asemenea, în acest caz, modelul este robust pentru modificările valorilor parametrilor ( Nota complementară 3 și Fig. 6c, d ).

Schimbarea pragului de ubicitalizare EGFR

Apoi am folosit EAM pentru a prezice parametrii a căror modificare consecventă (adică, de 10 ori mai mare sau mai mică) ar schimba pragul de ubicuitate. Analiza a identificat rata EGFR kinazei, k Kin , în acord cu MPM-B, iar numărul total de EGFRs, R T , care nu a fost prezent în MPM-B ( fig. 7a ). În comparație cu k KIN , R T poate fi ușor manipulat și, prin urmare, am validat predicția prin atenuarea expresiei EGFR în celulele HeLa prin knockdown incomplet ( Fig.7b ). În aceste condiții, o scădere aproximativ de patru ori a nivelurilor EGFR (de la ~ 3 × 10 5 la~ 7 × 10 4 EGFR pe fiecare celulă, măsurată printestul de legare la saturație 125 I-EGF, vezi Metodele) a schimbat spre dreapta curba de ubicuitate, similar cu cel obținut în simulări ( Fig.7c și Fig.7 ).

Figura 7: Downmodularea nivelurilor EGFR modifică curba de răspuns la doză-răspuns a ubiquitinării.
Figura 7

( A ) Am variat fiecare parametru al EAM de 10 ori și calculat Coeficientul de sensibilitate S pentru EGFR ubiquitinarea poziția prag x T . Au fost raportate numai parametrii a căror variație a determinat un coeficient de sensibilitate de cel puțin 0,1. ( b ) Knockdownul EGFR (KD) în celulele HeLa a fost realizat prin transfecție cu un oligo siRNA anti-EGFR. Celulele de control au fost transfectate cu oligo necorespunzător. Celulele au fost apoi tratate timp de 2 minute cu EGF așa cum este indicat. IP și IB au fost prezentate. Cuantificarea ubiquitinării EGFR este prezentată în secțiunea c . ( c) Comparație între predicțiile model și evaluarea experimentală a pragului de ubicuitate în celule HeLa EGFR-KD (KD) și control (WT). Au fost realizate simulări cu EAM (în simularea EGFR-KD scăderea nivelurilor EGFR a fost de 4,2 ori, așa cum s-a determinat în testele de legare la saturație 125 I-EGF). Ubiquitinizarea EGFR este exprimată, pentru fiecare condiție, normalizată la valoarea maximă obținută în această stare (Ub / Ub MAX ). Datele experimentale sunt raportate ca medie ± sd din cel puțin trei experimente independente.

În concluzie, ghidat de EAM, am identificat numărul total de EGFR-uri de suprafață ca parametru-cheie în controlul poziției pragului de ubiquitinizare și am confirmat această predicție experimental.

Decuplarea / recuplarea fosforilării și ubiquitinării RFCE

Apoi am interogat EAM ca la comportamentul EGFR ubiquitinarea și fosforilarea într - o gamă de niveluri de receptori care se întind nivele fiziologice (<10 5 EGFRs per celulă) la nivelurile patologice detectate în tumorile umane (> 10 6 EGFRs per celulă), la concentrații diferite de EGF ( figura 8a ). La toate concentrațiile de EGF, ubiquitinizarea medie EGFR per receptor (normalizată la ubiquitinizarea maximă obținută la 100 ng ml- 1 EGF) a prezentat o curbă în formă de clopot. Interesant este faptul că vârful este treptat deplasat către nivelurile superficiale ale suprafeței EGFR, deoarece concentrația EGF crește ( Figura 8a). În contrast, vârful fosforilării per receptor (normalizat la fosforilarea maximă obținută la 100 ng ml -1 EGF) se deplasează către niveluri superioare ale suprafeței EGFR ( Fig.8a ).

Figura 8: Model avansat pentru EGFR Ub și pY ca funcție de concentrația EGF și numărul EGFR.
Figura 8

( a ) Fosforilarea EGFR relativă stângă (pY / EGFR T , linii negre) și nivelele de ubiquitinizare (Ub / EGFR T , linii roșii), așa cum sunt date de EAM, pentru concentrațiile indicate de EGF. Aria gri reprezintă intervalul fiziologic al nivelurilor EGFR. Dungile liniare indică fosforilarea maximă și ubicitinarea. Datele sunt normalizate la nivelul maxim de fosforilare / ubiquitinizare la 100 ng ml -1 EGF. Pătrările roșii și cercurile negre reprezintă măsurători experimentale ale EGFR Ub și, respectiv, pY, obținute prin analiza pe bază de ELISA în clone NIH-EGFR cu un număr tot mai mare de EGFR (de la cel mai mic la cel mai mare: NIH-EGFR phy , EGFR fiziologic, NIH-EGFR m-ov , supraexprimare medie; NIH-EGFRh-ov , supraexprimare înaltă). Drept, imagini reprezentative de imunofluorescență ale nivelurilor de suprafață EGFR în clonele NIH-EGFR indicate. Scară bar, 18 μm. Doză, număr de EGFR de suprafață per celulă, măsurată prin legarea saturației 125 I-EGF. ( b ) Ubiquitinizarea EGFR relativă stângă (stânga, Ub / EGFR T , linia roșie) și fosforilarea (dreapta, pY / EGFR T , linia neagră), dată de EAM, pentru concentrația indicată EGF normalizată la maxim. Pătrările reprezintă măsurători experimentale ale ubiquitinării EGFR (stânga) sau fosforilare (dreapta), obținute prin testul pe bază de ELISA în clonele NIH-EGFR indicate (roșu) sau liniile celulare cu numărul EGFR în creștere (negru, vezi și Figura 9 complementară ) . (c ) nivelele de ubiquitinizare EGFR relativ (Ub / EGFR T ), așa cum au fost date de EAM, la 100 ng ml- 1 EGF sub control (linia roșie) sau Cbl supraexprimare (linia punctată de culoare roșie) line cu datele din figura 4b ). Datele sunt normalizate la ubiquitinizarea maximă în fiecare condiție. Pătrările și cercurile roșii reprezintă măsurători experimentale ale ubiquitinării EGFR, obținută prin analiza ELISA, în clonele NIH-EGFR (ca în a ) infectate cu un vector lentiviral care conduce la supraexprimare Cbl inductibilă (Cbl oe, cercuri roșii) sau vectorul gol (Vector, pătrate roșii), tratat cu doxociclină. Exact, verificarea supraexprimării Cbl în clonele NIH-EGFR indicate, infectate cu vectorul gol (-) sau cu vectorul inductibil de Cbl supraexprimare (+); tubulină, controlul încărcării. Analiza densitometrică a relevat o ~ supraexpresie 80-100 ori CBL de CBL. Datele experimentale în a - c sunt raportate ca fiind medii ± sd din cel puțin trei experimente independente.

Am testat predicțiile modelului prin măsurarea curbelor de ubiquitinizare și fosforilare a dozei-răspuns în liniile celulare care exprimă cantități crescătoare de EGFR. Pentru a efectua experimente într-un fond genetic omogen, am folosit fibroblaste NIH 3T3, care prezintă niveluri endogene scăzute de EGFR ( ~ 10,000 EGFR pe fiecare celulă) și le transfecta cu un vector de expresie care codifică EGFR-WT umană. Apoi am selectat trei clone NIH-EGFR reprezentative pentru: (i) starea fiziologică ( ~ 7 × 10 4 EGFR pe celulă, celule PHY de EGFR ); (ii) supraexpresia moderată ( ~ 2 x 10 5 EGFRs per celulă, EGFR m-ov celule); (iii) supraexprimare înaltă ( ~ 6 × 105 EGFR pe fiecare celulă, celule EGFR h-ov ). Cele trei clone au prezentat expresia omogenă a receptorului la nivelul unei singure celule ( fig.8a dreapta) și au prezentat un număr comparabil de molecule Cbl / Grb2 ca celule HeLa ( figurile suplimentare 8 și 9a ). Analiza răspunsului dozei EGF pentru ubiquitinizarea și fosforilarea medie a EGFR pe receptor în clone a confirmat decuplarea predictivă a curbelor doză-răspuns de fosforilare și ubiquitinizare, ca funcție a nivelurilor EGFR ( Fig.8a ).

Am extins analiza noastră pentru a include un număr de linii de celule tumorale care prezintă cantități crescătoare de EGFR (HeLa, CASKI, BT20), comparativ cu o linie de celule fibroblaste normale (WI38, Figura 9 suplimentar ). De asemenea, în acest caz sa observat o reducere dramatică a ubiquitinării EGFR, la concentrații ridicate de EGF, ca funcție a nivelurilor EGFR ( Fig.8b ).

Modelul nostru a capturat, de asemenea, comportamentul unui mutant EGFR (L834R) care apare în cancerul pulmonar (revizuit la punctul 43 ) și afișează fosforilarea crescută împreună cu scăderea legării la Cbl și ubiquitinarea 11 , 44 , 45 , 46 , 47 . Conform modelului, în acest context, curbele Ub și pY sunt decuplate deja la nivelele fiziologice ale EGFR ( figura suplimentară 11 și nota complementară 4 ), furnizând o posibilă explicație a motivului pentru care acest mutant este tumorigen în absența supraexprimării receptorilor și / sau supraproducția ligandului.

Prezența curbelor în formă de clopot poate fi explicată prin saturarea reacțiilor care conduc atât la fosforilare cât și la ubiquitinizare când EGFR crește și concentrația EGF rămâne constantă. Când EGFR crește peste nivele fiziologice, dozele mici de EGF sunt diluate între receptori și fosforilarea medie pe receptor scade. Cu toate acestea, la concentrații ridicate de FEG, ligandul nu mai este diluat, chiar și la niveluri non-fiziologice ale EGFR, iar fosforilarea medie pe receptor nu scade cu EGFR. Ubiquitinizarea, totuși, scade și în acest caz deoarece necesită Cbl, ceea ce este limitator. Astfel, în ciuda creșterii EGFR-urilor "ubiquitinatabile", fracția de receptor ubiquitinat scade la EGF înalt în condiții de supraexprimare a RFCE.

În sprijinul acestei interpretări am putea restabili ubicitinizarea în condiții de supraexprimare a EGFR, atât în silico cât și experimental, prin creșterea nivelurilor de Cbl ( Fig.8c și Fig .

DiscuţieDiscuţie

Pragul de ubicitalizare este determinat printr-un mecanism de "detectare a coincidenței" a două reziduuri Tyr în EGFR printr-un complex Grb2: Cbl. În acest mecanism, două componente sunt pivotale: (i) probabilitatea și (ii) cooperativitatea.

Datele experimentale au demonstrat că fosforilarea Y1045 și fie Y1068 sau Y1086 este necesară și suficientă pentru ubiquitinizarea completă a EGFR. Fosforilarea concomitentă a două resturi Tyr are loc printr-un procedeu pur probabilist, deoarece reziduurile Tyr de pe EGFR sunt fosforilate independent unul de celălalt. Aceasta implică faptul că, în timp ce probabilitatea ca fosforilațiile Tyr individuale să crească treptat cu concentrația de ligand, probabilitatea de a avea două, trei sau mai multe reziduuri Tyr fosforilate nu este. Într-adevăr, fosforilarea multiplă va fi nesemnificativă la concentrații scăzute de FGF și va crește brusc după o valoare critică a EGF.

În plus, eforturile noastre de modelare au demonstrat că doar probabilitatea este necesară, dar nu este suficientă, pentru a genera pragul, fiind necesară și cooperativitatea. Cooperativitatea este determinată de prezența lui Grb2. Deși Grb2 nu contribuie direct la ubiquitinizarea EGFR, legarea Cbl la EGFR și ubiquitinizarea receptorilor scad dramatic atunci când Grb2 nu poate lega receptorul. Într-adevăr, o predicție clară a modelului este că, dacă ubiquitinarea ar necesita doar un pY, nu ar arăta un comportament de prag. O astfel de situație a fost verificată experimental de către mutantul Y1045 +. În acest context, Cbl se leagă de EGFR fără contribuția lui Grb2. Deși a scăzut foarte mult, am putut detecta ubicitinația în acest mutant. Cu toate acestea, nu am respectat nici un prag. Acesta este și comportamentul așteptat al unui sistem ipotetic în care Grb2 și Cbl nu se leagă în mod cooperativ la EGFR. În acest caz, efectele de prag, atât pentru legarea Cbl, cât și pentru ubicitatia EGFR, sunt negate, după cum arată simulările noastre.

În aval de legarea Cbl la EGFR, modelul nu a necesitat constrângeri specifice suplimentare pentru a ține cont de efectul de prag. Într-adevăr, nu a fost necesar să se introducă în model modelul suplimentar de control al activității ligandului Cbl. Acest lucru se datorează faptului că legarea Cbl la EGFR afișează un profil de prag foarte asemănător cu curba de omniprezență EGFR. Astfel, propunem ca legarea Cbl să fie factorul major care determină generarea pragului.

În concluzie, cooperativitatea necesită o combinație de reziduuri Tyr multiple pentru ubiquitinizare, în timp ce mecanismul probabilistic garantează că o astfel de combinație nu apare în mod natural decât la concentrații ridicate de FGF.

Modelul MPM-B constă din două module: fosforilarea (MPM) și legarea Cbl și Grb2 (B). În ambele module, ne-am propus să folosim cele mai standarde reprezentări matematice ale reacțiilor chimice: fosforilarea este descrisă ca un lanț de reacții multisite standard, legarea Grb2 și Cbl este o acțiune de masă simplă și cooperativitatea este introdusă în mod canonic. Observațiile cheie pe care am construit MPM-B sunt direct încorporate în cablarea rețelei: (i) în model, constanta de disociere a Cbl pentru EGFR scade în prezența lui Grb2, în acord cu faptul că Grb2 se stabilizează legarea între EGFR și Cbl; (ii) în regimul liber, fosforilarea reziduurilor Tyr este inerent independentă de numărul lor (care ne-a permis, de asemenea, să restrângem analiza la cele trei reziduuri Tyr critice); (iii) modelul urmărește pragul de ubiquitinizare la legarea Cbl la EGFR. Pentru alegerea parametrilor, observăm că mulți dintre ei au fost fie bine constrânși, fie experimentați. Activarea EGFR a fost modelată prin introducerea unei funcții fenomenologice, care ne-a împiedicat să introducem numeroși parametri care descriu dinamica reală a activării EGFR. Fosforilarea a fost caracterizată prin montarea curbelor doză-răspuns. Legarea Cbl și Grb2 la EGFR depinde de concentrațiile proteinei și de afinitățile de legare: concentrațiile proteinei au fost măsurate cu atenție, în timp ce afinitățile de legare au fost determinate indirect prin potrivirea curbelor doză-răspuns ale ubiquitinării în diferite condiții experimentale, în constrângeri experimentale bine definite, ( observăm că mulți dintre ei erau fie constrânși, fie experimentați. Activarea EGFR a fost modelată prin introducerea unei funcții fenomenologice, care ne-a împiedicat să introducem numeroși parametri care descriu dinamica reală a activării EGFR. Fosforilarea a fost caracterizată prin montarea curbelor doză-răspuns. Legarea Cbl și Grb2 la EGFR depinde de concentrațiile proteinei și de afinitățile de legare: concentrațiile proteinei au fost măsurate cu atenție, în timp ce afinitățile de legare au fost determinate indirect prin potrivirea curbelor doză-răspuns ale ubiquitinării în diferite condiții experimentale, în constrângeri experimentale bine definite, ( observăm că mulți dintre ei erau fie constrânși, fie experimentați. Activarea EGFR a fost modelată prin introducerea unei funcții fenomenologice, care ne-a împiedicat să introducem numeroși parametri care descriu dinamica reală a activării EGFR. Fosforilarea a fost caracterizată prin montarea curbelor doză-răspuns. Legarea Cbl și Grb2 la EGFR depinde de concentrațiile proteinei și de afinitățile de legare: concentrațiile proteinei au fost măsurate cu atenție, în timp ce afinitățile de legare au fost determinate indirect prin potrivirea curbelor doză-răspuns ale ubiquitinării în diferite condiții experimentale, în constrângeri experimentale bine definite, ( care ne-au ajutat să introducem numeroși parametri care descriu dinamica reală a activării EGFR. Fosforilarea a fost caracterizată prin montarea curbelor doză-răspuns. Legarea Cbl și Grb2 la EGFR depinde de concentrațiile proteinei și de afinitățile de legare: concentrațiile proteinei au fost măsurate cu atenție, în timp ce afinitățile de legare au fost determinate indirect prin potrivirea curbelor doză-răspuns ale ubiquitinării în diferite condiții experimentale, în constrângeri experimentale bine definite, ( care ne-au ajutat să introducem numeroși parametri care descriu dinamica reală a activării EGFR. Fosforilarea a fost caracterizată prin montarea curbelor doză-răspuns. Legarea Cbl și Grb2 la EGFR depinde de concentrațiile proteinei și de afinitățile de legare: concentrațiile proteinei au fost măsurate cu atenție, în timp ce afinitățile de legare au fost determinate indirect prin potrivirea curbelor doză-răspuns ale ubiquitinării în diferite condiții experimentale, în constrângeri experimentale bine definite, (Tabelul suplimentar 1 ).

Nu este surprinzător, simplitatea relativă a modelului a venit cu un cost. În ciuda acordului general, există domenii în care am observat unele divergențe între modelare și experimente. În primul rând, curbele experimentale ale ubiquitinării EGFR au prezentat întotdeauna un grad mai mare de sigmoidicitate decât in silicosimulări, sugerând că conversia analogică-digitală care funcționează în viața reală este mai eficientă decât în ​​predicțiile modelului. În al doilea rând, supraexprimarea celulelor Cbl în celule HeLa nu reproduce predicțiile modelului în termeni cantitativi exacți. În acest caz, predicțiile de model și experimentele pot fi făcute să fie de acord cantitativ doar dacă presupunem că 1/3 din moleculele Cbl supraexprimate sunt într-adevăr capabile să se lege la receptor. Există posibilitatea ca în modelul nostru să lipsească câțiva parametri ai rețelei de reglementare Cbl (de exemplu, fosforilarea, homo- și heterodimerizarea, contracția cu deubiquitinaze 40 , 48 , 49 , 50) care, deși nu sunt esențiale pentru a genera pragul, ar putea ajuta la rafinarea descrierii matematice a sistemului. Viitoarele versiuni ale modelului vor aborda aceste discrepanțe.

Efectul de prag prezis de MPM-B a fost robust la modificările valorilor parametrilor, o proprietate care a fost verificată în celule reale. În special, ștergerea resturilor Tyr (cu excepția Y1068, Y1086 și Y1045), supraexprimarea Cbl și exprimarea unui Cbl70Z mutant negativ Cbl (modelat ca downregulation) nu au deplasat pragul, în setările modelate și experimentale. În plus, deși sistemul biologic și modelul nu sunt la starea de echilibru, calitativ proprietățile modelului (adică pragul, dependența de nivelul EGFR și lipsa efectului perturbațiilor Cbl asupra pragului) nu depinde strict de timp (nu este prezentat). Robustețea este rezultatul diferitelor mecanisme care funcționează în diferitele module ale rețelei: reziduurile Tyr nu se afectează reciproc " fosforilarea s, i supraexprimarea Cbl nu afectează pragul deoarece Cbl este limitat în sistem; astfel, o creștere a Cbl conduce la aceeași creștere proporțională a ubiquitinării EGFR pentru toate concentrațiile de EGF.

Pentru a identifica perturbațiile care ar putea modifica poziția pragului, a trebuit să extindem MPM-B pentru a crea EAM, care include detaliile moleculare ale activării EGFR care, în MPM-B, au fost ascunse în relația fenomenologică dintre EGF și Activarea EGFR. Interesant, EAM a afișat, de asemenea, o robustețe remarcabilă pentru modificarea parametrilor. În consecință, majoritatea parametrilor modelului nu au putut fi obținute prin simpla montare a datelor experimentale ( nota complementară 2 ), dar au trebuit să fie constrânse experimental; din acest motiv, fie le-am măsurat direct, fie le-am obținut valorile din literatură (a se vedea tabelul suplimentar 1). Complexitatea crescută a EAM a dus la generarea unei predicții, verificată experimental, că poziția pragului poate fi înlocuită prin reducerea nivelurilor EGFR, deoarece reduce capacitatea EGFR de a dimeriza și de a fi activat. Un element cheie este că dimerii nu sunt stabili, fiind formați și întrerupți continuu, conform datelor recente 51 .

O predicție importantă validată a EAM se referă la răspunsul ubicitării EGFR la variațiile nivelurilor EGFR. Sistemul prezintă un comportament complex care depinde atât de nivelurile receptorilor, cât și de concentrația ligandului și pare să fi evoluat astfel încât răspunsul maxim să fie în intervalul fiziologic al nivelurilor EGFR. La aceste niveluri (indicată printr-o zonă umbrită în figura 8a ), sistemul răspunde la creșterea concentrației de EGF cu o creștere congruentă a nivelurilor relative ale ubiquitinării EGFR. Deoarece ubiquitinizarea EGFR este cuplată la internalizarea receptorului prin calea NCE 21 , 23, aceasta înseamnă că, în intervalul fiziologic destul de larg al EGFR (care acoperă o ordine de mărime), celula este bine echipată pentru a răspunde la creșterea concentrației de ligand cu degradarea crescută a receptorului, pentru a se proteja de suprastimulare. Situația este destul de diferită dacă se iau în considerare nivelurile EGFR superficiale. În aceste condiții, modelul a prezis și experimentele au confirmat că ubiquitinizarea relativă a receptorului scade mult mai brusc decât fosforilarea receptorului ( Fig.8a ), ceea ce s-ar traduce într-o atenuare relativă mai rapidă a degradării mediate de NCE în ceea ce privește semnalizarea.

Aceste constatări sunt foarte relevante pentru cancerele umane. În tumori, EGFR este frecvent supraexprimat. Datele noastre arată că, atât într-un model isogenic cât și în liniile celulare tumorale, există o decuplare progresivă a fosforilării și ubiquitinării EGFR la nivelul EGFR suprafiziologic. Efectul este evident pentru concentrațiile de FEG mai mari de 1 ng ml -1 : o afecțiune frecventă în tumorile umane, în care supraexprimarea EGFR este frecvent însoțită de supraproducția liganzilor 52 , 53 , 54(și referințele din acestea). În alte condiții, optimizarea sistemului pentru nivelurile FGFR fiziologice, de asemenea, prezintă o slăbiciune intrinsecă, care este exploatată de celulele canceroase pentru a obține un avantaj proliferativ. La rândul său, acest punct de slăbiciune, identificat acum, ar putea constitui un punct de intervenție adecvat în scopuri terapeutice.

metodemetode

Modele RFCE

Simulăm trei modele diferite, cu o complexitate crescândă prin intermediul ecuațiilor diferențiale obișnuite. MPM ( figura 2d, e ) urmărește doar fosforilarea EGFR. Activarea EGFR este descrisă ca o funcție Hill a [EGF]. MPM-B ( figurile 4 și 5 și figurile complementare 2 , 3b, c , 4 și 5 ) este MPM cu adăugarea de legare Grb2 și Cbl la EGFR și unul la celălalt. În EAM ( figurile 6b-d , 7a, c și 8a-c și figura complementară 11), modelul complet, activarea EGFR este descrisă în detalii moleculare, în timp ce reacțiile de legare pentru Cbl și Grb2 sunt aceleași ca în cazul MPM-B. Detalii suplimentare pentru modelele utilizate în studiu pot fi găsite în nota complementară 1 .

Au fost efectuate simulări cu XPP-AUT ( http://www.math.pitt.edu/ ~ bard / xpp / xpp.html ). Condițiile inițiale au fost alese pentru a avea toate speciile la starea de echilibru, în absența stimulului FEG. În momentul zero, stimulează celulele cu EGF. Estimarea parametrilor a fost efectuată utilizând o metodă globală de optimizare bazată pe o recoacere simulată, urmată de o optimizare locală bazată pe metoda simplex. Fișierele SBML sunt disponibile la biomodels.org (EAM: MODEL1505190000; MPM-B: MODEL1505190001).

Reactivi și anticorpi

EGF a fost de la PeproTech; 125 I-EGF de la PerkinElmer. Anticorpii au fost după cum urmează: un anti-EGFR policlonal intern împotriva aa 1172-1186 al EGFR uman (concentrație de lucru în imunoblot, IB: 0,06 pg ml- 1 ); un anti-EGFR monoclonal (hibridomul m108, îndreptat împotriva domeniului extracelular al EGFR uman, American Type Culture Collection (ATCC) 55 , concentrație de lucru: în imunofluorescență IF, 3 pg ml- 1 ); anti-pY (clona 4G10, Millipore # 05-231; concentrație de lucru IB: 1 pg ml -1 ; concentrație de lucru în imunoprecipitare, IP, 10 pg pentru 1 mg de lizat); anti-Ub (P4D1, Santa Cruz Biotechnology, # sc-8017, utilizat în toate IB-urile anti-Ub la o concentrație de lucru de 0,2 pg ml- 1); anti-Ub FK2 (Enzo Life Science, # BML-PW8810, utilizat în toate testele ELISA, pentru concentrația de lucru vezi secțiunea de mai jos); anticorpi anti-EGFR fosfo-specifici (semnalizare celulară, pY1045 # 2237, pY1068 # 2234, diluție de lucru IB: 1: 1000); in-house anti-alfa-tubulină policlonală crescută la șobolan (MAB1864, clona YL1 / 2, concentrația de lucru IB: 1,87 mg ml- 1 ); anti-Grb2 (Clona 81, BD Biosciences, # 610112, IB concentrație de lucru: 0,125 pg ml- 1 ); anti-CBL policlonal (clona 15, Santa Cruz Biotechnology, # sc-170, IB concentrație de lucru: 0,4 pg ml -1 ) și monoclonal (BD Bioscience, # 610442, dacă concentrația de lucru: 0,5 ug ml -1 ) anticorpi.

Construcții și linii celulare

Celulele HeLa, NIH 3T3, WI38, CASKI și BT20 au fost obținute de la ATCC și cultivate după instrucțiunile ATCC. Toate liniile de celule umane au fost autentificate la fiecare înghețare de loturi prin profilare STR (StemElite ID System, Promega). Toate liniile celulare au fost testate pentru micoplasma la fiecare înghețare cu ajutorul PCR 56 și analiză biochimică (MycoAlert, Lonza). Celulele HeLa transfectate cu Cbl sau Cbl70Z au fost descrise anterior 57 . Mutantele EGFR au fost exprimate stabil (vezi figura 21 ) în celule NR6, care sunt fibroblaste de șoarece lipsite de EGFR endogen 58 . EGFR expresia de suprafață în transfectanți a fost evaluată prin legarea de saturație cu 125I -EGF (ref 21 ).

EGFR WT uman a fost exprimată stabil în celule NIH 3T3. Clonele unice au fost izolate și caracterizate pentru nivelurile de exprimare a suprafeței EGFR și omogenitate prin imunofluorescență (IF; Fig.8a , panoul din dreapta). Pe scurt, celulele au fost fixate în paraformaldehidă 4% și au fost colorate (înainte de permeabilizare) cu anticorpul monoclonal anti-EGFR care recunoaște domeniul extracelular (m108). Celulele au fost apoi incubate cu anticorp secundar conjugat cu Alexa488 (Molecular Probes) și colorați cu 4,6-diamidino-2-fenilindol. Clonele care exprimă diferite niveluri de EGFR de suprafață, evaluate prin legarea de saturație cu 125I -EGF, au fost selectate pentru analiză suplimentară ( Figura 8a, panoul din dreapta). Aceste clone au fost ulterior infectate cu un construct lentiviral inductibil care conține ADNc care codifică c-Cbl uman (pSLIK-neo vector 59 ). Acest construct a fost conceput pornind de la un ADNc c-Cbl furnizat de Y. Yarden (Weizmann Institute, Israel). Toate clonele au fost verificate în secvență; detalii sunt disponibile la cerere.

S-au obținut populații voluminoase stabile după 10 zile de tratament cu neomicină (400 ug ml- 1 ). La tratarea doxiciclina (0,5 ug ml -1 timp de 16 h), CBL a fost exprimată la niveluri ~ 80-100 ori mai mari decât cele ale proteinei endogene (evaluată prin analiza densitometria OI la expuneri diferite, Fig. 8c ) și afișat un nivel de expresie omogen (evaluat prin IF, Figura 10 suplimentar ). Aceleași clone infectate cu vectorul gol au fost tratate cu doxiciclină în același mod și au fost utilizate ca martor ( Figura 8c ).

Tratamentul cu EGF a fost timp de 2 minute la 37 ° C. În aceste condiții, internalizarea EGFR este neglijabilă, iar evenimentele de fosforilare și ubicuitate observate apar în primul rând la PM 21 .

Test de legare la saturație

Celulele fără celule serice au fost incubate pe gheață timp de 6 ore în prezența 125 I-EGF (100 ng ml -1 : 10 ng ml- 1 de 125 I-EGF plus 90 ng ml- 1 EGF rece) în ser liber mediu suplimentat cu 0,5% BSA. Celulele au fost apoi spălate de trei ori cu PBS răcit cu gheață și solubilizate în 1 M NaOH. După corectarea diluției la cald / rece, numărul de receptori de pe suprafață a fost dedus din activitatea specifică a ligandului marcat. Legarea nespecifică a fost măsurată în prezența unui exces de 300 de ori al EGF rece, și nu a fost niciodată> 3-10% din numărul total.

Distrugerea EGFR în celule HeLa

Silentarea EGFR în celulele HeLa a fost realizată prin transfecție dublă tranzitorie, folosind OligofectAMINE (Invitrogen), a oligonucleotidului (ARN) cu interferență scurtă (siRNA) (SteRyn siRNA de la Invitrogen): 5'-CCGCAGCAUGUCAAGAUCACAGAUU-3 '. Secvența oligo-ului de control neadecvat a fost: 5'-CCGACGUGUAACUAGCACGACAAUU-3 '. Celulele au fost analizate 48 de ore după a doua transfecție.

Teste biochimice

Liza litiazică a fost realizată în tampon RIPA (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% Triton-X100, 1% deoxicolat de sodiu, 0,1% SDS), plus cocktail inhibitor de protează (CALBIOCHEM) și inhibitori ai fosfatazei mM pirofosfat de sodiu pH 7,5, 50 mM NaF, 2 mM PMSF, 10 mM Na 3 VO 4pH 7,5). Pentru a exclude prezența proteinelor co-imunoprecipitare, pentru testele ELISA, liza a fost efectuată în tampon RIPA conținând 1% SDS, urmată de limpezire timp de 1 oră la 120.000 g și diluție până la o concentrație SDS finală de 0,2%. Au fost realizate imunoprecipitări (IP) pornind de la 500 pg de lizați, cu anticorpii adecvați. IP-urile au fost incubate timp de 2 ore la 4 ° C și apoi s-a adăugat Proteina G (Zymed) timp de 1 oră. După spălare intensă cu tampon RIPA, IP-urile au fost eluate în tampon Laemmli. Imobolitul (IB) a fost efectuat așa cum s-a descris anterior 57 , 60 . Cuantificarea bloturilor a fost efectuată cu Photoshop.

Determinarea numărului de molecule Cbl și Grb2

Pentru a calcula numărul de molecule Grb2 sau Cbl în HeLa ( Figura 3b ), NIH-EGFR ( Figura complementară 8 ) sau CASKI / BT20 ( Figura 9d), am comparat intensitățile semnalului în anti-Grb2 sau anti-Cbl IB cu cantități crescute de lizat de celulă cu cantități cunoscute de proteină Grb2 sau Cbl purificată. Din compararea semnalului și ținând cont de numărul lui Avogadro, am calculat numărul de molecule Grb2 și Cbl pe μg de lizat. După o corecție suplimentară pentru numărul de celule HeLa sau NIH-EGFR corespunzând la 1 pg de lizat (măsurat în același experiment), am obținut numărul total de molecule Grb2 și Cbl per celulă. Pentru a calcula numărul de molecule Cbl active (Cbl pY), am Cbl IP Tyr-fosforilat, folosind anticorpul anti-pY, din cantități crescătoare de lizat (preparat în tampon RIPA conținând SDS 1%) din celulele stimulate cu EGF (100 ng ml- 1) timp de 2 minute. Imunoprecipitatele au fost apoi IB cu anti-Cbl, iar intensitățile semnalului benzilor anti-Cbl au fost comparate cu intensitățile semnalului benzilor anti-Cbl în lizatele celulare IB și proteina Cbl purificată. Am corectat valorile obținute pentru eficiența IP (estimat> 90%) și am obținut% din Cbl în lizatul fosforilat (activ) pe stimularea cu EGF (100 ng ml -1 ) timp de 2 minute.

Testele ELISA pentru ubiquitinizarea și fosforilarea RFCE

Pentru testele bazate pe ELISA prezentate în figura 8 și în figura 7 complementară, am folosit tehnologia Discovery Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay de la Perkin Elmer. Această tehnologie se bazează pe recunoașterea sandwich a unei proteine ​​țintă de către un anticorp de captare și un anticorp de detectare. Anticorpul de captare este imobilizat pe o suprafață solidă (microplaci) direct prin legături ne-covalente. După adăugarea analitului (lizatul celular adecvat), detectarea semnalelor se bazează pe un anticorp conjugat cu lantanidă (Europium) care este capabil să producă un semnal fluorescent la amplificare cu tampon de creștere acidă. Lizatele au fost preparate în tampon RIPA / 1% SDS și diluate până la 0,2% SDS înainte de etapa de incubare. Prepararea plăcii, incubarea analitului și detectarea anticorpilor au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile producătorului (detalii suplimentare sunt prezentate la punctul 21 ).

Ca capturarea anticorpi au fost utilizate următoarele: anticorpi monoclonali împotriva Ub (FK2, 5 ug ml -1 ), pY (4G10, 5 ug ml -1 ), pY1068 (1 pg ml -1 ), pY1086 (1 pg ml -1 ) sau EGFR (m108, 1 pg ml- 1 ); ca anticorpi de detectare s-au utilizat următoarele: anti-EGFR policlonal in-house îndreptat împotriva aa 1172-1186 de EGFR uman (1 pg ml- 1 ).

Densitometrie și analiză statistică

Cuantificarea bloturilor a fost efectuată cu Photoshop. În toate experimentele, densitometria a fost efectuată pe diferite expuneri ale bloturilor și rezultatele au fost obținute în faza liniară a expunerii. Rezultatele medii, calculate din cel puțin trei experimente independente, sunt afișate. Clasele de eroare de pe parcele reprezintă semnul

Informatii suplimentareInformatii suplimentare

Cum se citează acest articol: Capuani, F. și colab. Analiza cantitativă arată modul în care activarea și reglarea RFCE sunt cuplate în celulele normale, dar nu în celulele canceroase. Nat. Commun. 6: 7999 doi: 10.1038 / ncomms8999 (2015).

ReferințeReferințe

  1. 1.

    & Semnalizarea EGF-ERBB: către nivelul sistemelor . Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7 , 505-516 (2006).

  2. 2.

    & Cell de semnalizare prin receptori tirosin kinaze . Cell 141 , 1117-1134 (2010).

  3. 3.

    Cell de semnalizare prin receptori tirozin kinaze . Cell 103 , 211-225 (2000).

  4. 4.

    și colab. EGF își activează receptorul prin eliminarea interacțiunilor care autoinhibă dimerizarea ectodomaină . Mol. Cell 11 , 507-517 (2003).

  5. 5.

    și colab. Structura cristalină a complexului de domenii extracelulare ale factorului de creștere epidermal uman și receptorului . Cell 110 , 775-787 (2002).

  6. 6.

    și colab. Structura cristalină a unui domeniu extracelular al receptorului factorului de creștere epidermică trunchiată legat de factorul de creștere alfa de transformare . Celula 110 , 763-773 (2002).

  7. 7.

    și colab. Mecanism pentru activarea domeniului catalitic al receptorului EGF de către segmentul juxtamembranar . Celula 137 , 1293-1307 (2009).

  8. 8.

    , & Activarea dimerilor receptorului EGF preformat prin rotația indusă de ligand a domeniului transmembranar . J. Mol. Biol. 311 , 1011-1026 (2001).

  9. 9.

    și colab. Regiunea juxtamembranară a receptorului EGF funcționează ca un domeniu de activare . Mol. Cell 34 , 641 - 651 (2009).

  10. 10.

    și colab. Conjugarea conjugativă a membranei plasmatice în activarea receptorului EGF . Cell 152 , 543-556 (2013).

  11. 11.

    , , , & Un mecanism alosteric pentru activarea domeniului kinazei receptorului factorului de creștere epidermal . Cell 125 , 1137-1149 (2006).

  12. 12.

    , , , & Rapidă fosfo-fluctuație de către receptorii tirozin kinazelor influențează semnalizarea în aval și legarea medicamentului . Mol. Celula 43 , 723-737 (2011).

  13. 13.

    , , , & activarea EGFR cuplată la inhibarea fosfatazelor tirozinei determină propagarea laterală a semnalului . Nat. Cell Biol. 5 , 447-453 (2003).

  14. 14.

    , & Analiza computațională a reglării EGFR de fosfataze proteice tirozinice . Biophys. J. 102 , 2012-2021 (2012).

  15. 15.

    & Recrutarea dinamică a fosfatazei proteice tirozin PTPD1 la situsurile de stimulare a EGF potențează activarea EGFR . PLoS ONE 9 , e103203 (2014).

  16. 16.

    și colab. Activitatea ligandului ubiquitin și fosforilarea tirozinei subliniază suprimarea semnalizării factorului de creștere de către c-Cbl / Sli-1 . Mol. Cell 4 , 1029-1040 (1999).

  17. 17.

    , , & interacțiune directă a CBL cu Ptir 1045 receptorului EGF (EGFR) este necesară pentru a sorta EGFR la lizozomii pentru degradare . Exp. Cell Res. 300 , 388-395 (2004).

  18. 18.

    , , , & Reglarea diferențială a internalizării și degradării receptorului EGF prin multiubiquitinizare în domeniul kinazei . Mol. Cell 21 , 737-748 (2006).

  19. 19.

    și colab. c-Cbl / Sli-1 reglează sortarea și ubiquitinizarea endocitară a receptorului factorului de creștere epidermal . Genele Dev. 12 , 3663-3674 (1998).

  20. 20.

    , , , & Mecanismele multiple reglementează colectiv endocitoza mediată de clathrin a receptorului factorului de creștere epidermal . J. Cell Biol. 189 , 871-883 (2010).

  21. 21.

    și colab. Pragul-controlate ubiquitination a EGFR directe destinul receptorului . EMBO J. 32 , 2140-2157 (2013).

  22. 22.

    și colab. Endocitoza independentă de clathrin a încărcăturilor ubiquitinate . Proc. Natl Acad. Sci. USA 102 , 2760-2765 (2005).

  23. 23.

    , , , , & internalizarea mediată de Clathrin este esențială pentru semnalizarea RFCE susținută, dar dispensabilă pentru degradare . Dev. Celula 15 , 209-219 (2008).

  24. 24.

    & Recrutarea mediată de receptorul de legare a receptorului factorului de creștere 2 al regiunii CING a receptorului factorului de creștere epidermal este esențială și suficientă pentru a susține endocitoza receptorului . Mol. Biol. Cell 16 , 1268-1281 (2005).

  25. 25.

    , , & Grb2 reglează internalizarea receptorilor EGF prin gropi acoperite cu clathrin . Mol. Biol. Cell 14 , 858-870 (2003).

  26. 26.

    și colab. Un receptor mutant EGF defect în ubicitate și endocitoză prezintă un rol pentru Grb2 în semnalizarea negativă . EMBO J. 21 , 303 - 313 (2002).

  27. 27.

    , , & Un model integrat al traficului receptorilor factorului de creștere epidermică și al transducției semnalului . Biophys. J. 85 , 730 - 743 (2003).

  28. 28.

    , , & Modelarea computațională a dinamicii cascadei kinazei MAP activată de către receptorii EGF de suprafață și internalizați . Nat. Biotechnol. 20 , 370-375 (2002).

  29. 29.

    , , & Cuantificarea semnalizării pe termen scurt a receptorului factorului de creștere epidermal . J. Biol. Chem. 274 , 30169-30181 (1999).

  30. 30.

    și colab. Comportamentul intrare-ieșire al căilor de semnalizare ErbB, așa cum reiese dintr-un model de acțiune de masă, instruit împotriva datelor dinamice . Mol. Syst. Biol. 5 , 239 (2009).

  31. 31.

    , , , , & Răspunsurile dependente de ligand ale rețelei de semnalizare ErbB: analize experimentale și modelare . Mol. Syst. Biol. 3 , 144 (2007).

  32. 32.

    , , , & Un mecanism de sortare ultrasensibil pentru endocitoza receptorului EGF . BMC Syst. Biol. 2 , 32 (2008).

  33. 33.

    , , & Un model de rețea al evenimentelor precoce în semnalizarea receptorului factorului de creștere epidermal care explică complexitatea combinatorică . Biosystems 83 , 136-151 (2006).

  34. 34.

    & Heterogenitatea în afinitățile de legare a EGF rezultă din cooperativitatea negativă într-un sistem de agregare . Proc. Natl Acad. Sci. USA 105 , 112-117 (2008).

  35. 35.

    , & Atunci când ubiquitinizarea întâlnește fosforilarea: o perspectivă biologică a sistemelor de semnalizare EGFR / MAPK . Cell Commun. Semnal. 11 , 52 (2013).

  36. 36.

    și colab. Analiza integrată experimentală și bazată pe modele dezvăluie aspectele spațiale ale dinamicii activării EGFR . Mol. Biosyst. 8 , 2868-2882 (2012).

  37. 37.

    și colab. Globalizarea, in vivo și dinamica fosforilării specifice site-ului în rețelele de semnalizare . Celula 127 , 635-648 (2006).

  38. 38.

    Întrebări și răspunsuri: cooperativitate . J. Biol. 8 , 53 (2009).

  39. 39.

    & Inteluctomul Cbl și funcțiile acestuia . Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6 , 907-918 (2005).

  40. 40.

    și colab. Baza structurală pentru autoinhibirea și activarea dependentă de fosforilare a c-Cbl . Nat. Struct. Mol. Biol. 19 , 184-192 (2012).

  41. 41.

    & Reglementarea activității proteinei ligazei ubiquitin în c-Cbl prin schimbarea conformatională indusă de fosforilare și activarea constitutivă prin mutații de tip tirozină la glutamat . J. Biol. Chem. 279 , 28017-28027 (2004).

  42. 42.

    , , & Un model bazat pe structură pentru legarea ligandului și dimerizarea receptorilor EGF . Proc. Natl Acad. Sci. USA 101 , 929-934 (2004).

  43. 43.

    , , & Mutațiile receptorilor factorului de creștere epidermal în cancerul pulmonar . Nat. Rev. Cancer 7 , 169-181 (2007).

  44. 44.

    și colab. Structuri ale mutanților EGFR derivați de cancer pulmonar și complecși ai inhibitorilor: mecanismul de activare și înțelegerea sensibilității inhibitorului diferențial . Cancer Cell 11 , 217 - 227 (2007).

  45. 45.

    și colab. Tipuri de activare distinctivă în mutanți EGFR sensibili la constitutive și gefitinib sensibili . Oncogene 25 , 1205-1215 (2006).

  46. 46.

    și colab. Deficiența ubiquitinilizării mutanților EGFR ai cancerului pulmonar conferă semnalizare prelungită . Oncogene 26 , 6968-6978 (2007).

  47. 47.

    și colab. Mutațiile oncogene contracarează tulburarea intrinsecă în kinaza EGFR și promovează dimerizarea receptorului . Cel. 149 , 860-870 (2012).

  48. 48.

    și colab. Baze structurale pentru dimerizarea mediată de UBA a ligasei ubiquitin c-Cbl . J. Biol. Chem. 282 , 27547-27555 (2007).

  49. 49.

    și colab. Baze structurale pentru dimerizarea mediată de ubiquitină și activarea ligandului proteinei ubiquitin Cbl-b . Mol. Cell 27 , 474-485 (2007).

  50. 50.

    , și Guvernarea traficului endocitar și semnalizarea prin ubiquitatelare reversibilă . Dev. Celula 23 , 457-467 (2012).

  51. 51.

    și colab. Controlul spațial al activării receptorului EGF prin dimerizare reversibilă asupra celulelor vii . Natura 464 , 783-787 (2010).

  52. 52.

    Dependența receptorului factorului de creștere epidermal în tumorile umane: mai mult decât expresie? Oncolog 7 , (Suppl 4): 31-39 (2002).

  53. 53.

    & Deregulat EGFR de semnalizare în timpul progresiei cancerului pulmonar: mutații, amplicoane, și bucle autocrine . Cancer Prev. Res. (Phil.) 1 , 156-160 (2008).

  54. 54.

    , , , & Mecanisme pentru activarea oncogenică a receptorului factorului de creștere epidermal . Semnalul celular 19 , 2013-2023 (2007).

  55. 55.

    și colab. Eficacitatea anticorpilor la receptorul factorului de creștere epidermal împotriva carcinomului KB in vitro și la șoarecii nudi . J. Natl Cancer Inst. 80 , 1605-1611 (1988).

  56. 56.

    & Detectarea contaminării cu micoplasma în culturile celulare prin reacția în lanț a polimerazei . Metode Mol. Biol. 731 , 93-103 (2011).

  57. 57.

    și colab. Structura cristalină a domeniilor de legare la ubiquitină ale rabex-5 relevă două moduri de interacțiune cu ubiquitin . Cell 124 , 1183-1195 (2006).

  58. 58.

    & Variante ale celulelor 3T3 care nu au răspuns mitogen la factorul de creștere epidermal . Proc. Natl Acad. Sci. USA 74 , 3918-3921 (1977).

  59. 59.

    și colab. O singură platformă de vector lentiviral pentru interferența ARN condiționată de microRNA și expresia transgene coordonată . Proc. Natl Acad. Sci. USA 103 , 13759-13764 (2006).

  60. 60.

    și colab. Un singur motiv responsabil de recunoașterea ubiquitinei și monoubiquitinarea în proteinele endociate . Natura 416 , 451-455 (2002).

  61. 61.

    și colab. Baza de date BioModels: o resursă îmbunătățită, curated și adnotată pentru modelele kinetice cantitative publicate . BMC Syst. Biol. 4 , 92 (2010).

  62. 62.

    Simularea stochastică exactă a reacțiilor chimice cuplate . J. Phys. Chem. 81 , 2340-2361 (1977).

Descărcați referințe

RecunoasteriRecunoasteri

Mulțumim lui Rosalind Gunby pentru citirea critică a manuscrisului. Această lucrare a fost susținută de granturile de la Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro către SP (IG 11627), AC (IG 12972) și PPDF (IG 10349 și 14404 și MCO 10.000); MIUR (Ministerul italian al cercetării științifice și universitare), Ministerul Sănătății din Italia, Consiliul European pentru Cercetare (Proiectul Mammastem) și Fundația Monzino la PPDF; Cariplo (2008-2263) către SP și AC, Comunitatea Europeană (Rețeaua de excelență FP6, 100601-201012) către PPDF și SPACo. este susținută de părtășie de la Fondazione Italiana Ricerca sul Cancro. EAM și MPM-B au fost depuse în baza de date BioModels 61 și au fost atribuite identificatorul MODEL1505190000 și MODEL1505190001, respectiv.

Informatia autoruluiInformatia autorului

Note de autor

    • Fabrizio Capuani
    •  & Alexia Conte

    Acești autori au contribuit în mod egal la această lucrare.

    • Pier Paolo Di Fiore
    • , Sara Sigismund
    •  & Andrea Ciliberto

    Acești autori au supravegheat în comun această activitate.

    • Fabrizio Capuani

    Adresa actuală: Dipartimento di Fisica, Sapienza Università di Roma, Piazzale A. Moro 5, 00185, Roma, Italia

    • Elisabetta Argenzio

    Adresa actuală: Institutul de Cancer din Olanda, Amsterdam, Olanda

Afilieri

  1. IFOM, Fundația franceză Oncologia Molecolare, Via Adamello 16, Milan 20139, Italia

    • Fabrizio Capuani
    • , Alexia Conte
    • , Elisabetta Argenzio
    • , Simona Polo
    • , Pier Paolo Di Fiore
    • , Sara Sigismund
    •  & Andrea Ciliberto
  2. Universitatea de Cercetare-Universitatea din Trento Centrul de Biologie Computațională și Sisteme (COSBI), Piazza Manifattura 1, Rovereto (TN) 38068, Italia

    • Luca Marchetti
    •  & Corrado Priami
  3. Dipartimento di Matematica, Università di Trento, Via Sommarive 14, Povo 38100, Italia

    • Corrado Priami
  4. Dipartimento di Scienze della Salute, Università degli Studi di Milano, Via di Rudinì 8, Milano 20122, Italia

    • Simona Polo
    •  & Pier Paolo Di Fiore
  5. Istituto Europeo di Oncologia, Via Ripamonti 435, Milano 20141, Italia

    • Pier Paolo Di Fiore

Autori

  1. Căutați pe Fabrizio Capuani în:

  2. Căutați pe Alexia Conte în:

  3. Căutați pe Elisabetta Argenzio în:

  4. Căutați pe Luca Marchetti în:

  5. Căutați pe Corrado Priami în:

  6. Căutați pe Simona Polo în:

  7. Căutați pe Pier Paolo Di Fiore în:

  8. Caută Sara Sigismund în:

  9. Căutați pe Andrea Ciliberto în:

contribuţii

FC a dezvoltat modelul matematic, a participat la proiectarea experimentală și la scrierea hârtiei. A.Co. a efectuat majoritatea experimentelor. EA a efectuat experimente de supraexprimare Cbl. LM a efectuat și CP supravegheat analiza de identificare. SP a participat la proiectarea experimentală. PPDF a proiectat experimentele, a analizat datele și a scris co-scris. SS a proiectat experimentele, a analizat datele și a scris co-scris. A.Ci. a supervizat modelul de construcție, a participat la proiectarea experimentală și analiza datelor, și a co-scris lucrarea.

Concurenți interesați

Autorii nu declară interese financiare concurente.

Autorii corespondenți

Corespondență cu Pier Paolo Di Fiore sau Sara Sigismund sau Andrea Ciliberto .

Informatie suplimentaraInformatie suplimentara

Fișiere PDF

  1. 1.

    Informatie suplimentara

    Figurile suplimentare 1-11, Tabelele complementare 1-2, Notele complementare 1-4 și Referințele suplimentare

Fișiere text

  1. 1.

    Set de date suplimentar

    Modelul de fosforylare multisite

Despre acest articolDespre acest articol

Istoria publicării

Primit

Admis

Publicat

DOI

https://doi.org/10.1038/ncomms8999

Drepturi și permisiuni

Creative Commons BYAceastă lucrare este licențiată sub licență Creative Commons Attribution 4.0 International License. Imaginile sau alte materiale ale unor terțe părți din acest articol sunt incluse în licența Creative Commons a articolului, cu excepția cazului în care se indică altfel în linia de credit; dacă materialul nu este inclus în licența Creative Commons, utilizatorii vor trebui să obțină permisiunea titularului licenței de a reproduce materialul. Pentru a vedea o copie a acestei licențe, vizitați http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Distribuiți acest articol

Orice persoană cu care împărțiți următorul link va putea citi acest conținut:

ComentariiComentarii

Prin trimiterea unui comentariu, sunteți de acord să respectați Termenii și Regulile comunității . Dacă găsiți ceva abuziv sau care nu respectă termenii sau indicațiile noastre, vă rugăm să îl marcați ca neadecvat.


(Mediafax)


Linkul direct catre Petitie

CEREM NATIONALIZAREA TUTUROR RESURSELOR NATURALE ALE ROMANIEI ! - Initiativa Legislativa care are nevoie de 500.000 de semnaturi - Semneaza si tu !

Comentarii:


Adauga Comentariu



Citiți și cele mai căutate articole de pe Fluierul:

Trădătoare BREXIT-ului.

Directorul, SEX cu profa de matematică în şcoală. Elevii au filmat pe ascuns. VIDEO XXX

#REZIST – Procurorii DIICOT investigheaza cum au intrat în Romania peste 14.000.000 $ pentru a finanta grupari #rezist pro DNA, Iohannis. Pistele conduc la „portofel virtual” de pe BLOCKCHAIN, al ONG-ului Stefan Batory finantat de Soros

SEX TAPE made in Romania: 4 vedete autohtone FILMATE făcând perversităţi VIDEO

Celula este un SUPERCOMPUTER. Cum are loc Transcripția ADN-ului în ARN-mesager şi mai apoi Translația ARN-ului-mesager în proteine. Care sunt asemănările cu un Program de Calculator?

Directorul, SEX cu profa de matematică în şcoală. Elevii au filmat pe ascuns. VIDEO XXX

ORGIE în toaleta unui club din România. Totul a fost filmat cu un telefon mobil. VIDEO

TOP 10 cele mai bune ACTRIŢE PORNO din istorie. Sau cum sunt manipulați tinerii de mici FOTO

Prezentatoare TV în sânii goi, după ce a fost trădată de rochie în direct VIDEO

Cum fac SEX rusoaicele, nemţoaicele sau italiencele. Clipul care a făcut senzaţie pe net VIDEO

Privatizarea Sănătății sau Șmecheria lui Dragnea: Salariu Brut Relativ Mare.....dar toți banii curg la Asigurările Sociale, ce urmeaza a fi Privatizate care sunt TRIPLE față de Polonia. Asiguratorii Privați îți freacă deja mâinile de fericire

eNational anunță că "The Movement" - "Mișcarea" lui Steve Bannon (agreată și de Donald Trump) va susține coagularea forțelor conservatoare din România

Smartphone Nokia la 100 de lei și Samsung Galaxy S8 cu preț INCREDIBIL. eMAG dezvăluie 10 produse din oferta de Black Friday

Filme porno şi orgii sexuale într-o instituţie publică din Timişoara

Finlanda:Întreruperea semnalului GPS din timpul recentelor exerciții militare NATO a venit din Rusia

Incident ȘOCANT cu un membru al forțelor speciale Navy SEALS. Iată ce IMAGINE terifiantă au primit prietenii de la el, pe când militarul se afla în Irak. Procurorii au deschis o anchetă

Textul rugăciunii "Tatăl Nostru" va fi modificat. Se schimbă un fragment de frază

eMag, ofertă de Black Friday 2018: Samsung Galaxy S8 la 1.500 de lei, televizor de 80 cm la 400 de lei

Cu toții o știm și o iubim pe FETIȚA ZURLI. CUM ARATĂ în realitate, cum o CHEAMĂ de fapt și ce VÂRSTĂ are | VIDEO

Horoscop zilnic: Horoscopul zilei pentru VINERI 16 NOIEMBRIE 2018. Venus iese din retrograd, Mercur intra

Avionul Egyptair prăbuşit: Analiza uneia din cutiile negre arată că s-a pronunţat cuvântul "foc"

Cum a reușit Traian să pună mâna pe comoara dacilor ascunsă sub râul Sargeția. Aurul strămoșilor noștri a salvat Roma de la colaps

Horoscop weekend 17-18 noiembrie. Pe cine aşteaptă o mare dezamăgire în dragoste. Nu vă lăsaţi duşi de val

Cele mai bune filme erotice pe care le-ai ratat - Video

Cum s-a trăit în România în anii '70- '80? UNII VĂ MINT spunându-vă că s-a trăit permanent prost între anii 1965 - 1989.

Analiza Gramaticala - Clasele V - VIII

Armata europeană, nouă prioritate a cuplului franco-german. Ce este această armată europeană și de ce strnește ea furia SUA

Ce distribuie un deputat PSD pe Facebook: Dragă Uniune Europeana, ești o curvă satanistă

Accident mortal în Colentina

O fostă majoretă a făcut SEX cu un elev de 15 ani! Filmul XXX a ajuns pe INTERNET. VIDEO

​Video-interviu. Socialistă europeană, despre gestul lui Iordache: Oribil, bădărănesc/ PSD ar trebui exclus din rndul socialiștilor europeni, dacă va continua să fie capturat de oameni corupți, ca Dragnea

Cum recunoașteți modelele străvechi de pe IE față de cele inventate recent. Cum recunoști o IE cu modele străvechi românești, de UN KITSCH.

Doliu în televiziunea românească. Prezentatoarea de la "Steaua fără nume" şi "Floarea din grădină" a murit

HOROSCOP 17 NOIEMBRIE 2018: Decizia pe care o iei azi poate şoca pe multă lume. Previziuni complete de weekend

Il Giornale: Rezultatul șocant al unei anchete privind Franța: și păstrează jumătate din banii donați pentru Africa

O nouă tragedie. România a pierdut un mare duhovinc. Preotul a murit fulgerător în urma unui infarct

Doi bărbaţi, condamnaţi la moarte pentru genocid. Sunt responsabili de moartea a aproape două milioane de oameni

Scandalul asistenților romni din Suedia cu diplome fără să fi fost la școală: Ministerul Educației face controale la o școală postliceală / Jurnalista din Suedia care a lucrat la anchetă povestește de la ce a pornit totul

A fost inaugurat Drumul Unirii, care leagă Bistrița-Năsăud de Maramureș prin Munții Țibleșului | FOTO

Jean-Claude Juncker s-a făcut din nou de râs. Acum a apărut în public cu doi pantofi de culori diferite VIDEO

FOTO / Soția lui Kamara, goală pe internet! Vezi reacția artistului

Maria Ghiorghiu, profeţie teribilă despre România: "Blocurile erau pe marginea prăpastiei"

Black Friday 2018. Ce să nu cumperi NICIODATĂ de VINEREA NEAGRĂ. Mulţi români şi-au luat ţeapă

Bancul zilei: Cel mai minunat soț

INTERVIU EVENIMENT | Adrian Sârbu-Ion Cristoiu, față în față. "Jurnaliștii adevărați sunt nemuritori". EXCLUSIV DE LA ORA 12.00

INTERVIU | Hagi 2.0. Cum a crescut Ianis sub îndrumarea "Regelui", cât de tentante sunt ofertele din străinătate și ce spune despre posibilitatea de a evolua pentru naționala Turciei: "Sunt mândru că port numele ăsta"

Experții ONU și-au scurtat vizita n Ungaria/ Autoritățile nu le permit să verifice zonele de tranzit pentru refugiați

Topul celor mai sigure țări din lume pentru călătorii. Care este situația în România

Băsescu: Tot ce fac Dragnea, Tăriceanu, Dăncilă este diletantism. Bruxelles-ul o să-i răspundă "rămâi mămică suverană, dar nu ne mai căuta"

Financial review Prima pagină a presei străine: n rugăciunea Tatăl Nostru va fi nlocuit un vers. Interviu cu Manfred Werner, posibil viitor șef al CE. Theresa May promite să lupte pentru Brexitul ei. Vestele galbene, un fenomen dificil de definit

Horoscop weekend 16-18 noiembrie 2018. După impulsivul Marte, acum şi Luna este în Peşti! Cum îţi schimbă zilele?

UE E FEUDA LUI SOROS. Fluierul.ro vă prezintă în premieră pentru România întâlnirile lui SOROS cu Comisarii UE de la Bruxelles pe ore, minute, zile, săptămâni, luni, ani...Ghiciți cu cine s-a întâlnit SOROS la Bruxelles chiar pe 1 februarie 2018?

O nouă tragedie la Iași: O asistentă a murit după ce a fost lovită de o mașină pe o trecere de pietoni

Exclusiv Digi 24: Nigel Farage, reacție dură după rezoluția PE n cazul Romniei. Mesajul pentru romni

Plantaţie de lavandă şi goji în locul fabricii metalurgice promise la Olteniţa. Ce surprize a pregătit familia Gupta pentru Galaţi?

Accident horror pe autostradă, 42 de morţi şi 27 de răniţi. Autobuzul a sărit în aer de la canistrele unui călător

Frumoasa asta fură meserie de la Busu

MIREASĂ prinsă de CAVALERUL de ONOARE în timp ce îşi înşela SOŢUL: Cine este BĂRBATUL ăsta? VIDEO

Germania: Ministrul de interne ia în considerare expulzări de refugiați spre Siria

HOROSCOP 16 NOIEMBRIE 2018: Ziua împinge multe zodii pe căi nebătătorite. Previziunile zilei

Un cutremur de 2,7 grade pe scara Richter s-a produs în zona seismică Vrancea

Inundaţii în deşert. Cămilele s-au speriat de puhoaiele de apă VIDEO

Caru cu vedete: Mihai Bobonete, reacție fabuloasă după ce a văzut delfini din pluș cu penis ntr-un magazin; Regina a fost sufletul petrecerii la ziua Prințului Charles; Delia s-a mbrăcat n culori fondante și a făcut show printre acadele, la Sala Palatului

O viitoare mireasă a aflat că partenerul o înșela chiar cu o seară înainte de nuntă. A reușit să se abțină, iar ce a făcut tânăra în fața altarului a fost total NEAȘTEPTAT. "Tu o vei face?"

Theresei May i fuge pămntul de sub picioare: 48 de parlamentari conservatori au demarat procedura pentru demiterea ei

Un adolescent de 17 ani a lovit cu maşina o femeie, apoi a fugit de la locul accidentului

Cele mai nepotrivite zodii pentru o relatie pe termen lung

Producătorul biscuiților Oreo, vizat de Greenpeace pentru salvarea urangutanilor

BLACK FRIDAY 2018 ALTEX. Catalogul celor mai mari reduceri

Șansele migranților din America Centrală de a intra în SUA sunt ''practic nule'', e ''foarte riscant'' (ministru)

Estonia se alătură statelor care refuză să adere la pactul ONU privind migrația

Retenţia de apă. Cum să elimini balonarea şi excesul de apă din corp în doar 4 zile!

Turneul Campionilor | Federer a spulberat temerile fanilor și și-a luat o dulce revanșă: s-a calificat pentru a 15-a oară în semifinale. Clasamentul final în Grupa "Hewitt" + când revine pe teren elvețianul

Replica dată de Macron lui Trump: Nu fac politică sau diplomație prin mesaje pe Twitter

Căutat de justiția progresistă controlată de cine trebuie, fostul premier macedonean conservatorul Nikola Gruevski a fugit n Ungaria, unde a cerut azil politic

"Mărimea contează", o tânără şi-a dat în judecată iubitul. Ce acuzaţii inedite îi aduce femeia după ce cuplul s-a destrămat

CALENDAR ORTODOX 2018: Mare sărbătoare, de ce se lasă oalele cu gura-n jos sâmbătă. Cum scapi de boli şi atragi norocul

Momentul în care Ecaterina Andronescu i-a făcut PRAF pe Liviu Dragnea și Viorica Dăncilă: "Pentru binele României..."

Primarul orașului Arad candidează la alegerile europarlamentare din 2019

HOROSCOP. Zodiile cu NOROC URIAŞ în următorii 5 ani. Se vor îmbogăţi rapid

ULTIMA ORĂ: Dică a anunțat unde se mută FCSB-ul! Sacrificiul făcut de gazde pentru vicecampioană: "Vor încerca să mute meciul pentru ca gazonul să nu se deterioreze"

Traian Băsescu îi ia apărarea soţiei lui Iohannis: De ce a trebuit să se afle public că doamna Iohannis e chemată ca martor la Parchet?

Unul dintre cele șapte filme pierdute Oswald a fost găsit n Japonia. Arhiva Disney a confirmat că este filmul este autentic

Actorii teatrului din Constanța care au semnat scrisoarea n care acuză abuzuri grave ale directoarei Dana Dumitrescu au fost dați afară din distribuția unui spectacol. Consiliul Județean Constanța anunță un control la teatru

6 ponturi feng shui pentru abundenţa ta financiară

Julian Assange, fondatorul WikiLeaks, a fost inculpat în secret în Statele Unite

(P) Top Shop a pregatit reduceri de pana la 70% de Black Friday 2018

Copilul jandarmeriţei din Suceava, ucisă pe o trecere de pietoni, a fost transferat la Bucureşti

Facebook va institui o curte de apel pentru evaluarea conținutului controversat

eMAG.ro BLACK FRIDAY, catalogul pe 2018. Peste 3 milioane de produse la reducere

ȘTIRILE OREI 09.00

Baschet: NBA - Houston Rockets renunță la serviciile lui Carmelo Anthony

Topul celor mai sigure ţări din lume, pentru turişti. România se află pe acelaşi loc cu Mexic şi Columbia, la unul dintre capitole

China cere companiilor tech să colecteze datele ct mai detaliate ale utilizatorilor

EXCLUSIV | Cluburile din Europa își îndreaptă atenția spre Liga 1: "Au fost discuții". Totul a fost confirmat! Când s-ar putea face mutările și despre ce echipe e vorba

Tenis: Turneul Campionilor - Federer l-a învins pe Anderson și s-a calificat în semifinale

SUA se pregătește să nceapă urmărirea penală a lui Assange

Wall Street Journal: Cel mai bun acord prost pe tema Brexit-ului. Acordul dnei May e groaznic dar este singurul

Tronsonul de autostradă A1 dintre Deva și Simeria a fost redeschis circulației după ce constructorul segmentului adiacent a terminat să amenajeze conexiunea cu Lotul 4 din A1 Lugoj - Deva

MOSTENIREA nestiuta a lui Ceausescu! America e SOCATA de ce a descoperit in Romania
ULTIMA ORA: Dusmanii tarii vor sa ascunda adevarul

Poveste adevărată. "Sunt Irina, am 20 de ani şi am facut videochat în..."

Fiica unui om de afaceri s-a spânzurat la 32 de ani, chiar înaintea nunţii. Mii de mesaje pe internet

Rugby: CSA Steaua, prima echipă calificată în semifinalele Cupei României

Exercițiu româno-american de apărare chimică, biologică, radiologică și nucleară

Au fost descoperite urmele celui mai mic dinozaur din lume. Acesta avea dimensiunile unei vrăbii şi tria în Asia VIDEO

n Canada a fost descoperit un organism care nu se ncadrează n niciun regn cunoscut. Este mai diferit de restul ființelor dect animalele de ciuperci

BILANȚUL LUI UEDZI DUPĂ 1 LUNA DE JOC +1.52. Cel mai tare program AI de Pariuri din Lume! Meciurile de AZI si ISTORICUL MECIURILOR din 15 septembrie 2018 alese și pariate de UEDZULA alintat UEDZI, programul de inteligență artificială al Fluierul.ro

VIDEO WTA: Finala Simona Halep vs Sloane Stephens, de la Montreal, meciul anului 2018

De ce s-a sinucis Oana Ioja. Motivul pentru care a recurs la GESTUL EXTREM

Mărturie ŞOCANTĂ a criminalului din Braşov care şi-a măcelărit familia. ESTE ÎNGROZITOR!

Guvernul Benjamin Netanyahu riscă să piardă majoritatea și să convoace alegeri anticipate

Consilierii generali USR cer prelungirea Planului Urbanistic General pentru a nu bloca piața construcțiilor: Gabriela Firea stă și privește cum Bucureștiul se scufundă

Cum a furat o femeie o brățară cu diamante de 85.000 lei, dintr-un mall din Capitală

Soluția autorităților din Brașov, după ce bradul de Crăciun a fost criticat de oameni

Experiența unui medic la ușa ministrului Sănătății: Am așteptat în frig o oră jumătate. Ce poate determina un ministru să ne cheme de la sute de km și să nu vină?

Dinamo - Concordia, amical cu porțile închise! Ce prim 11 folosesc Rednic și Dorinel Munteanu

VIDEO 15 ani de la debutul lui Lionel Messi la FC Barcelona

A expirat "creditul" lui Alibec. Antrenorul care nu s-a mai ferit de cuvinte: "Du-te, bă, frățioare și fă altceva!"

Meleșcanu l-a primit pe ambasadorul desemnat al Iranului; au fost abordate teme de actualitate de pe agenda regională și internațională

Ministerul Justiției transmite că OUG care reglementează cadrul de funcționare a Fondului Suveran Investiții poate fi neconstituțională


Pag.1 Pag.2 Pag.3 Pag.4 Pag.5 Pag.6 Pag.7
Pag.8 Pag.9 Pag.10 Pag.11 Pag.12 Pag.13 Pag.14 Pag.15
Pag.16 Pag.17

Nr. de articole la aceasta sectiune: 1972, afisate in 17 pagini.



11:48