_ Construirea 'pe- organoizi alveolari gel' ca o nouă platformă de screening

Un studiu condus de profesorul Shimpei Gotoh (Departamentul de Aplicații Clinice), introduce o nouă metodă de cultură pentru a genera organoizi alveolari potriviti pentru screening-ul cu randament mediu și mare și a identificat mai multe substanțe chimice cu efecte sinergice asupra diferențierii celulelor AT1. Lucrarea este publicată în revista Stem Cell Reports.

Alveolele, unitățile funcționale ale plămânului în care are loc schimbul de gaze, sunt compuse în principal din celule epiteliale alveolare de tip 1 și 2 (celule AT1 și, respectiv, AT2) . Pe lângă producția de surfactanți pulmonari, celulele AT2 sunt celule stem din țesut cuboidal care mențin homeostazia alveolară și reglează procesele regenerative în urma leziunii prin auto-reînnoire și diferențiere în celule AT1.

În schimb, celulele AT1 sunt subțiri și plate. celulele care formează cea mai mare parte a suprafeței alveolare pentru a media schimbul de oxigen și dioxid de carbon. Cunoștințele actuale despre mecanismele de semnalizare care stau la baza diferențierii AT1 de celulele AT2 se bazează în principal pe studiile la șoareci și rămâne neclar dacă există diferențe între specii în procesul de reglementare.

În plus, deși studiile au folosit în mod tradițional AT2 primar uman. celulelor, oferta lor limitată a împiedicat progresul în acest domeniu de cercetare. În mod alternativ, celulele iPS umane reprezintă un material de pornire valoros pentru studierea diferențierii celulelor epiteliale alveolare.

Laboratorul Gotoh a stabilit anterior protocoale de inducție pentru a genera celule AT2 din celulele iPS și pentru a crea organoizi alveolari din celulele iPS derivate de la pacient pentru modelarea bolii. Cu toate acestea, astfel de organoizi nu sunt optimi pentru procedurile de screening, deoarece necesită un număr mare de celule și sunt complet încorporați în Matrigel, un substrat de cultură celulară care seamănă cu mediul extracelular.

În prezentul studiu, cercetătorii au generat un nou dual. reporterul iPS monitorizează diferențierea celulelor AT1 și a derivat o nouă metodă „pe gel” pentru a cultiva organoizi alveolari prin însămânțarea progenitoarelor pulmonare derivate din celule iPS sau a celulelor AT2 deasupra Matrigel în plăci cu 96 de godeuri.

În timp ce alți markeri AT2 au arătat o expresie similară folosind această metodă, celulele AT2 din sferoizii rezultați au exprimat în special niveluri mai mari de proteină C surfactantă decât organoizii alveolari generați folosind protocoale stabilite anterior. În schimb, mai mulți markeri de celule AT1 au fost detectați la niveluri mai scăzute în sferoizii „pe gel”, ceea ce sugerează absența sau imaturitatea acestora.

Deși au fost detectate celule pozitive pentru markeri de celule AT1, analizele transcriptomice au confirmat o mai mare AT2- compoziția dominantă pentru acești sferoizi „pe gel”. În plus, celulele sferoide AT2 au prezentat caracteristici structurale care amintesc de celulele AT2 funcționale.

În totalitate, aceste observații au sugerat că noua metodă de cultură „pe gel”, care necesită un număr mic de celule pentru a genera și o manipulare mai ușoară, este optim pentru procedurile de screening pentru a identifica potențialii inductori ai diferențierii AT1.

Ca o dovadă a principiului, echipa de cercetare a efectuat un screening chimic de capacitate medie cu 274 de compuși folosind celule progenitoare pulmonare crescute cu ajutorul noului lor dezvoltat " „on-gel” și a constatat că 15 substanțe chimice au crescut semnificativ nivelurile reporterului specific celulei AT1.

Au validat în continuare acești compuși candidați examinând capacitatea lor de a îmbunătăți expresia genelor specifice celulei AT1. , AGER, CLIC5 și CAV1.

Printre acestea, LATS-IN-1 și ROCK-IN-2, cunoscuți ca inhibitori ai LATS1/2 și, respectiv, ROCK2, au crescut semnificativ aceste gene marker AT1. În plus față de constatarea că inhibarea LATS1/2 a promovat diferențierea AT1 prin activarea semnalizării YAP/TAZ, cercetătorii au descoperit, de asemenea, că ROCK-IN-2 induce expresia genelor legate de YAP/TAZ. Cu toate acestea, ambii compuși candidați au aglomerat sferoizii și au promovat proliferarea, proprietăți opuse celulelor AT1 (adică, celulele plate și subțiri repaus).

Au testat și alți inhibitori ROCK2, care nu au promovat diferențierea AT1, sugerând că capacitatea ROCK-IN-2 de a induce diferențierea AT1 este probabil atribuită unui efect în afara țintă asupra căii YAP/TAZ.

Alți patru compuși candidați au demonstrat efecte intermediare asupra expresiei genei markerului AT1 și au fost astfel testați pentru efecte sinergice în combinație cu LATS-IN-1 pentru a activa semnalizarea YAP/TAZ. În special, BAY1125976, un inhibitor alosteric AKT, a îmbunătățit sinergic expresia genei AT1 atunci când este combinat cu LATS-IN-1.

În timpul validării, cercetătorii au observat, de asemenea, efecte sinergice între LATS-IN-1 și alte două PI3K/ Inhibitori AKT, Alpelisib și AZD6482.

Descoperiri similare au fost observate atunci când o linie celulară iPS umană independentă sau celule AT2 primare au fost tratate cu aceeași combinație chimică. Prin analize transcriptomice, morfologice și funcționale suplimentare, cercetătorii au descoperit în mod constant că co-tratamentul LATS-IN-1 și BAY1125976 promovează schimbările celulare către un fenotip asemănător celulei AT1.

Prin generarea unui nou dual. reporter linie celulară iPS pentru a monitoriza diferențierea AT1 și pentru a stabili noua metodă de cultură sferoidă „pe gel” compatibilă cu screening-ul de mare randament, această lucrare recentă a identificat modulatorii chimici ai căilor de semnalizare YAP/TAZ și AKT ca un amestec de inductor puternic pentru celula AT1 diferențiere.

Cu posibilitatea de a adapta culturi sferoide „pe gel” pentru ecrane chimice de mare capacitate sau genetice bazate pe CRISPR/Cas, inovațiile dezvoltate în acest studiu vor contribui la propulsarea următoarelor descoperiri în sistemul pulmonar regenerativ. medicament.

(Fluierul)