_ Metoda microscopiei depășește limita tradițională de rezoluție pentru co-urmărirea rapidă a moleculelor

Cercetătorii de la Universitatea Ludwig Maximilian (LMU) au dezvoltat o metodă inovatoare pentru a urmări simultan procesele dinamice rapide ale mai multor molecule la scară moleculară.

Procesele din cadrul corpurile noastre se caracterizează prin interacțiunea diferitelor biomolecule, cum ar fi proteinele și ADN-ul. Aceste procese au loc la o scară adesea într-un interval de doar câțiva nanometri. În consecință, ele nu pot fi observate cu microscopia cu fluorescență, care are o limită de rezoluție de aproximativ 200 de nanometri din cauza difracției.

Când doi coloranți care marchează pozițiile biomoleculelor sunt mai aproape de această limită optică, fluorescența lor nu poate fi distinsă sub microscopul. Deoarece această fluorescență este utilizată pentru localizarea acestora, determinarea cu precizie a pozițiilor lor devine imposibilă.

Această limită de rezoluție a fost depășită în mod tradițional în metodele de microscopie cu super-rezoluție, făcând coloranții să clipească și pornind și oprindu-le fluorescența. Acest lucru le separă temporal fluorescența, făcând-o distinsă și permițând localizări sub limita clasică de rezoluție.

Cu toate acestea, pentru aplicațiile care implică studiul proceselor dinamice rapide, acest truc are un dezavantaj semnificativ: clipirea împiedică localizarea simultană a coloranți multipli. Acest lucru scade semnificativ rezoluția temporală atunci când se investighează procese dinamice care implică mai multe biomolecule.

Sub conducerea chimistului LMU, profesorul Philip Tinnefeld și în cooperare cu profesorul Fernando Stefani (Buenos Aires), cercetătorii de la LMU au dezvoltat acum multiplexarea pMINFLUX. , o abordare elegantă pentru a aborda această problemă.

Echipa a publicat o lucrare despre metoda lor în revista Nature Photonics.

MINFLUX este o metodă de microscopie de super-rezoluție, care permite localizări cu precizie de doar un nanometru. Spre deosebire de MINFLUX convențional, pMINFLUX înregistrează diferența de timp dintre excitația coloranților cu un impuls laser și fluorescența ulterioară cu rezoluție sub nanosecundă.

Pe lângă localizarea coloranților, aceasta oferă informații despre un alt element fundamental. proprietatea fluorescenței lor: durata de viață a fluorescenței. Aceasta descrie cât de mult durează, în medie, pentru ca o moleculă de colorant să fluoresce după ce este excitată.

„Durata de viață a fluorescenței depinde de colorantul utilizat”, explică Fiona Cole, co-autorul principal al publicației. . „Am exploatat diferențele de durată de viață a fluorescenței atunci când am folosit diferiți coloranți pentru a atribui fotonii fluorescenți colorantului care a emis fără a fi nevoie de clipire și separarea temporală rezultată.”

În acest scop, cercetătorii au adaptat algoritmul de localizare. și a inclus un model de potrivire multiexponențială pentru a obține separarea necesară.

"Acest lucru ne-a permis să determinăm poziția mai multor coloranți simultan și să investigăm procesele dinamice rapide între mai multe molecule cu precizie nanometrică", adaugă Jonas Zähringer, de asemenea, co. -primul autor.

Cercetătorii și-au demonstrat metoda urmărind cu precizie două fire de ADN în timp ce acestea săriu între diferite poziții pe o nanostructură origami ADN, precum și prin separarea mișcărilor de translație și rotație ale unei nanostructuri de origami ADN și prin măsurarea distanței dintre situsurile de legare la antigen ale anticorpilor.

„Dar acesta este doar începutul”, spune Philip Tinnefeld. „Sunt sigur că multiplexarea pMINFLUX, cu rezoluția sa temporală și spațială ridicată, va oferi noi perspective asupra interacțiunilor proteinelor și a altor fenomene biologice în viitor.”

(Fluierul)