Un grup de tipuri de coronavirusuri ale liliecilor în formă de SARS arată potențial de apariție umană

  • Un rectificativ la acest articol a fost publicat pe 06 aprilie 2016

Abstract

Apariția coronavirusului sindromului respirator acut sever (SARS-CoV) și al sindromului respirator din Orientul Mijlociu (MERS) -CoV subliniază amenințarea evenimentelor de transmitere a speciilor încrucișate care duc la focare la om. Aici examinăm potențialul de boală al unui virus asemănător cu SARS, SHC014-CoV, care circulă în prezent în populațiile chineze de lilieci de cai 1 . Utilizând sistemul de genetică inversă SARS-CoV 2, am generat și caracterizat un virus himeric care exprimă vârful coronavirusului liliec SHC014 pe coloana-vertebrală a virusului SARS-CoV, adaptată pentru șoarece. Rezultatele indică faptul că virusurile din grupa 2b care codifică vârful SHC014 într-o coloană vertebrală de tip sălbatic pot utiliza în mod eficient mai mulți ortologi ai receptorului SARS care transformă angiotensina umană a enzimei II (ACE2), se reproduc eficient în celulele căilor respiratorii umane primare și obțin titluri in vitro echivalente cu epidemie tulpini de SARS-CoV. În plus, in vivoexperimentele demonstrează replicarea virusului himeric în plămânul de șoarece, cu patogeneză notabilă. Evaluarea modalităților imunoterapeutice și profilactice bazate pe SARS a relevat eficacitatea slabă; atât anticorpii monoclonali cât și abordările vaccinului nu au reușit să neutralizeze și să protejeze de infecția cu CoVs folosind noua proteină spike. Pe baza acestor descoperiri, am re-derivat sintetic un virus infecțios SHC014 de lungime completă și am demonstrat o replicare virală robustă atât in vitro cât și in vivo . Lucrările noastre sugerează un risc potențial de reapariție a SARS-CoV din virușii care circulă în prezent în populațiile de lilieci.

Principal

Apariția SARS-CoV anunța o nouă eră în transmiterea încrucișată specii de boli respiratorii severe , cu globalizarea care duce la răspândirea rapidă în întreaga lume și impactul economic masiv 3 , 4 . De atunci, mai multe tulpini - inclusiv tulpinile de gripă A H5N1, H1N1 și H7N9 și MERS-CoV - au apărut din populațiile de animale, provocând boli, mortalitate și dificultăți economice considerabile pentru regiunile afectate 5 . Deși măsurile de sănătate publică au reușit să oprească focarul de SARS-CoV 4 , studii recente de metagenomică au identificat secvențe de viruși strâns înrudiți de tipul SARS care circulă în populațiile de lilieci chinezi care pot reprezenta o amenințare viitoare 1 , 6. Cu toate acestea, numai datele de secvență oferă informații minime pentru identificarea și pregătirea viitoarelor virusuri prepandemice. Prin urmare, pentru a examina potențialul de emergență (adică potențialul de a infecta omul) de CoV-uri circulare, am construit un virus himeric care codifică o nouă proteină spoon CoV zoonotică - din secvența RsSHC014-CoV care a fost izolată de liliecii de potcoava chinezi 1 - în contextul coloanei vertebrale adaptate la mouse SARS-CoV. Virusul hibrid ne-a permis să evaluăm capacitatea noii proteine ​​spike de a provoca boală independent de alte mutații adaptive necesare în coloana sa naturală. Utilizând această abordare, am caracterizat infecția cu CoV mediată de proteina spike SHC014 în celulele căilor respiratorii primare umane și in vivoși a testat eficacitatea terapeutice imunitare disponibile împotriva SHC014-CoV. Împreună, strategia traduce date metagenomice pentru a ajuta la prezicerea și pregătirea viitoarelor virusuri emergente.

Secvențele SHC014 și RsWIV1-CoV înrudite arată că aceste CoV sunt rudele cele mai apropiate de tulpinile epidemice SARS-CoV ( Fig. 1a, b ); cu toate acestea, există diferențe importante în cele 14 reziduuri care leagă ACE2 uman, receptorul pentru SARS-CoV, inclusiv cele cinci care sunt critice pentru gama gazdă: Y442, L472, N479, T487 și Y491 (ref. 7 ). În WIV1, trei dintre aceste reziduuri diferă de tulpina epidemică SARS-CoV Urbani, dar nu era de așteptat să modifice legarea la ACE2 ( Fig. 1a, b și Tabelul suplimentar 1 ). Acest fapt este confirmat de ambele experimente de pseudotipizare care au măsurat capacitatea lentivirusurilor care codifică proteinele spice WIV1 de a intra în celule care exprimă ACE2 uman ( Fig. 1 suplimentară) și prin teste de replicare in vitro ale WIV1-CoV (ref. 1 ). În schimb, 7 din 14 reziduuri de interacțiune ACE2 din SHC014 sunt diferite de cele din SARS-CoV, incluzând toate cele cinci reziduuri critice pentru intervalul gazdă ( Fig. 1c suplimentar și Tabelul suplimentar 1 ). Aceste modificări, însoțite de eșecul lentivirusurilor pseudotipate care exprimă vârful SHC014 de a intra în celule ( Fig. 1d suplimentară ), au sugerat că vârful SHC014 nu poate lega ACE2 uman. Cu toate acestea, au fost raportate modificări similare în tulpinile SARS-CoV înrudite care permit legarea ACE2 7 , 8, sugerând că pentru verificare a fost necesară o testare funcțională suplimentară. Prin urmare, am sintetizat vârful SHC014 în contextul coloanei vertebrale SARS-CoV, cu competență de replicare, competentă pentru șoareci (ne referim în continuare la CoV-ul himeric ca SHC014-MA15) pentru a maximiza oportunitatea studiilor de patogeneză și vaccin la șoareci ( Fig suplimentar 2a ). În ciuda predicțiilor atât din modelele bazate pe structură, cât și din experimentele de pseudotipare, SHC014-MA15 a fost viabil și a fost replicat la titluri înalte în celulele Vero ( Fig. 2b ). În mod similar cu SARS, SHC014-MA15 a necesitat, de asemenea, o moleculă funcțională de ACE2 pentru intrare și ar putea utiliza ortologi ACE2 umani, civet și bat ( fig. 2c, d suplimentar). Pentru a testa capacitatea spicului SHC014 de a media infecția căilor aeriene umane, am examinat sensibilitatea liniei de celule a căilor aeriene epiteliale umane Calu-3 2B4 (ref. 9 ) la infecție și am găsit o replicare robustă SHC014-MA15, comparabilă cu cea a SARS-CoV Urbani ( Fig. 1c ). Pentru a extinde aceste descoperiri, culturile epiteliale ale căilor aeriene umane primare (HAE) au fost infectate și au arătat o replicare robustă a ambelor virusuri ( Fig. 1d ). Împreună, datele confirmă capacitatea virusurilor cu vârful SHC014 de a infecta celulele căilor respiratorii umane și subliniază potențialul pericol de transmitere a speciilor încrucișate de SHC014-CoV.

Figura 1: virusurile asemănătoare cu SARS se reproduc în celulele căilor respiratorii umane și produc patogeneză in vivo .
figura 1

( a ) Secvențele genomului de lungime completă a CoV-urilor reprezentative au fost aliniate și mapate filogenetic așa cum este descris în Metodele Online . Bara de scară reprezintă substituții de nucleotide, cu doar suport de bootstrap peste 70% fiind marcat. Arborele prezintă COV-uri împărțite în trei grupări filogenetice distincte, definite ca α-CoVs, β-CoVs și γ-CoVs. Grupurile de subgrupuri clasice sunt marcate ca 2a, 2b, 2c și 2d pentru β-CoVs și ca 1a și 1b pentru α-CoVs. ( b ) Secvențele de aminoacizi din domeniile S1 ale vârfurilor β-CoV-urilor reprezentative ale grupului 2b, inclusiv SARS-CoV, au fost aliniate și mapate filogenetic. Bara de scară reprezintă substituții de aminoacizi. ( c , d) Replicarea virală a SARS-CoV Urbani (negru) și SHC014-MA15 (verde) după infecția celulelor Calu-3 2B4 ( c ) sau a unei culturi de celule HAE de interfață aer-lichid bine diferențiate ( d ) la o multiplicitate de infecție (MOI) de 0,01 pentru ambele tipuri de celule. Probele au fost colectate la momente individuale cu replici biologice ( n = 3) atât pentru experimentele de Calu-3, cât și pentru HAE. ( e , f ) Pierderea în greutate ( n = 9 pentru SARS-CoV MA15; n = 16 pentru SHC014-MA15) ( e ) și replicarea virală în plămâni ( n = 3 pentru SARS-CoV MA15; n = 4 pentru SHC014- MA15) ( f) de șoareci BALB / c în vârstă de 10 săptămâni infectați cu 1 × 10 4 pfu de SARS-CoV MA15 adaptat la șoarece (negru) sau SHC014-MA15 (verde) pe calea intranazală (în). ( g, h ) Sunt prezentate imagini reprezentative ale secțiunilor pulmonare colorate pentru antigenul SARS-CoV N de la șoarecii infectați cu SARS-CoV MA15 ( n = 3 șoareci) ( g ) sau SHC014-MA15 ( n = 4 șoareci) ( h ). Pentru fiecare grafic, valoarea centrală reprezintă media grupului, iar barele de eroare definesc barele de scară sem, 1 mm.

Pentru a evalua rolul spicului SHC014 în medierea infecției in vivo , am infectat șoareci BALB / c în vârstă de 10 săptămâni cu 10 4 unități de formare a plăcii (pfu) fie SARS-MA15, fie SHC014-MA15 ( Fig. 1e – h ). Animalele infectate cu SARS-MA15 au înregistrat pierderi rapide în greutate și letalitate cu 4 d post infecție (dpi); în schimb, infecția cu SHC014-MA15 a produs o pierdere substanțială în greutate (10%), dar nici o letalitate la șoareci ( Fig. 1e ). Examinarea replicării virale a relevat titluri virale aproape echivalente din plămânii șoarecilor infectați cu SARS-MA15 sau SHC014-MA15 ( Fig. 1f ). În timp ce plămânii de la șoarecii infectați cu SARS-MA15 au prezentat o colorare robustă atât în ​​bronhiolele terminale, cât și în parenchimul pulmonar 2 dpi ( Fig. 1g), cei de la șoarecii infectați cu SHC014-MA15 au prezentat o reducere a colorației antigenului căilor respiratorii ( Fig. 1h ); în schimb, nu a fost observat niciun deficit în colorarea antigenului în parenchim sau în scorul general al histologiei, ceea ce sugerează o infecție diferențiată a țesutului pulmonar pentru SHC014-MA15 ( Tabelul suplimentar 2 ). Am analizat ulterior infecția la animale mai sensibile, în vârstă (12 luni). Animalele infectate cu SARS-MA15 au pierdut rapid în greutate și au cedat la infecție ( fig. 3a suplimentară, b ). Infecția cu SHC014-MA15 a indus o pierdere în greutate robustă și susținută, dar a avut o letalitate minimă. Tendințele de histologie și modele de colorare a antigenului observate la șoarecii tineri au fost conservate la animalele mai în vârstă ( tabelul suplimentar 3). Am exclus posibilitatea ca SHC014-MA15 să medieze infecția printr-un receptor alternativ pe baza experimentelor folosind șoareci Ace2 - / - , care nu au prezentat pierderi în greutate sau colorare de antigen după infecția cu SHC014-MA15 ( Fig. 4a, b și suplimentar suplimentar) Tabelul 2 ). Împreună, datele indică faptul că virusurile cu vârful SHC014 sunt capabile să inducă pierderea în greutate la șoareci în contextul unei coloane vertebrale virulente CoV.

Având în vedere eficacitatea preclinică a terapiilor cu anticorpi monoclonali Ebola, cum ar fi ZMApp 10 , am urmărit ulterior să determinăm eficacitatea anticorpilor monoclonali SARS-CoV împotriva infecției cu SHC014-MA15. Patru anticorpi monoclonali umani care neutralizează în mare parte care vizează proteina spice SARS-CoV au fost raportați anterior și sunt reactivi probabili pentru imunoterapie 11 , 12 , 13 . Am examinat efectul acestor anticorpi asupra replicării virale (exprimat ca inhibare procentuală a replicării virale) și am constatat că în timp ce SARS-CoV Urbani de tip sălbatic a fost puternic neutralizat de către cei patru anticorpi la concentrații relativ mici de anticorpi ( Fig. 2a-d), neutralizarea a variat pentru SHC014-MA15. Fm6, un anticorp generat de afișarea fagului și mutanții de scăpare 11 , 12 , a atins doar niveluri de fond de inhibare a replicării SHC014-MA15 ( Fig. 2a ). În mod similar, anticorpii 230.15 și 227.14, care au fost obținuți din celulele B de memorie ale pacienților 13 cu SARS-CoV , nu au reușit să blocheze replicarea SHC014-MA15 ( Fig. 2b, c). Pentru cei trei anticorpi, diferențele dintre secvențele de aminoacizi spike SARS și SHC014 au corespuns la modificări directe sau adiacente de reziduuri găsite în mutanții de evacuare SARS-CoV (fm6 N479R; 230,15 L443V; 227,14 K390Q / E), ceea ce explică probabil absența anticorpilor „neutralizarea activității împotriva SHC014. În cele din urmă, anticorpul monoclonal 109.8 a fost capabil să obțină neutralizarea cu 50% a SHC014-MA15, dar numai la concentrații mari (10 μg / ml) ( Fig. 2d ). Împreună, rezultatele demonstrează că anticorpii care neutralizează pe scară largă împotriva SARS-CoV pot avea doar o eficacitate marginală împotriva tulpinilor de CoV emergente asemănătoare cu SARS, precum SHC014.

Figura 2: anticorpii monoclonali SARS-CoV au o eficacitate marginală împotriva CoV-urilor de tip SARS.
Figura 2

( a - d ) Analize de neutralizare evaluând eficacitatea (măsurată ca reducere a numărului de plăci) a unui panou de anticorpi monoclonali, care au fost generați inițial împotriva SARS-CoV epidemică, împotriva infecției celulelor Vero cu SARS-CoV Urbani (negru) sau SHC014-MA15 (verde). Anticorpii testați au fost fm6 ( n = 3 pentru Urbani; n = 5 pentru SHC014-MA15) 11 , 12 ( a ), 230,15 ( n = 3 pentru Urbani; n = 2 pentru SHC014-MA15) ( b ), 227,15 ( n = 3 pentru Urbani; n = 5 pentru SHC014-MA15) ( c ) și 109,8 ( n= 3 pentru Urbani; n = 2 pentru SHC014-MA15) 13 ( d ). Fiecare punct de date reprezintă media grupului și barele de eroare definesc sem. Rețineți că barele de eroare din celulele Vero infectate cu SARS-CoV Urbani în b , c sunt suprapuse de simboluri și nu sunt vizibile.

Pentru a evalua eficacitatea vaccinurilor existente împotriva infecției cu SHC014-MA15, am vaccinat șoareci în vârstă cu SARS-CoV (DIV) întreg inactivat. Lucrările anterioare au arătat că DIV ar putea neutraliza și proteja șoarecii tineri împotriva provocărilor cu un virus omolog 14 ; cu toate acestea, vaccinul nu a reușit să protejeze animalele în vârstă la care a fost observată și o patologie imună crescută, ceea ce indică posibilitatea animalelor de a fi vătămate din cauza vaccinării 15 . Aici am constatat că DIV nu a oferit protecție împotriva provocărilor cu SHC014-MA15 în ceea ce privește pierderea în greutate sau titrul viral ( Fig. 5a, b ). În concordanță cu un raport anterior cu alte grupuri heterologe 2b CoVs 15, ser de la șoareci vaccinați DIV vaccinați, de asemenea, nu au reușit să neutralizeze SHC014-MA15 ( Fig. 5c suplimentară ). În special, vaccinarea DIV a condus la o patologie imunitară robustă ( Tabelul suplimentar 4 ) și la eozinofilie ( Fig. 5d-f ). Împreună, aceste rezultate confirmă faptul că vaccinul DIV nu ar fi protector împotriva infecției cu SHC014 și ar putea mări eventual boala la grupul vaccinat în vârstă.

Spre deosebire de vaccinarea șoarecilor cu DIV, utilizarea SHC014-MA15 ca un vaccin viu, atenuat, a arătat o potențială protecție încrucișată împotriva provocării cu SARS-CoV, dar rezultatele au avut ca rezultat importante. Am infectat șoareci tineri cu 10 4 pfu de SHC014-MA15 și le -a observat pentru 28 d. Am contestat apoi șoarecii cu SARS-MA15 în ziua 29 ( Fig. 6a suplimentară ). Infecția anterioară a șoarecilor cu doza mare de SHC014-MA15 a oferit protecție împotriva provocării cu o doză letală de SARS-MA15, deși a existat doar un răspuns minim de neutralizare a SARS-CoV din antisera rezultat la 28 de zile după infecția SHC014-MA15 ( Fig. 6b suplimentar, 1: 200). În absența unui impuls secundar de antigen, 28 dpi reprezintă vârful preconizat al titlurilor de anticorpi și implică o reducere a protecției împotriva SARS-CoV în timp de 16 , 17 . Rezultate similare care demonstrează protecție împotriva provocării cu o doză letală de SARS-CoV au fost observate la șoarecii BALB / c în vârstă în ceea ce privește pierderea în greutate și replicarea virală ( Fig. 6c, d ). Cu toate acestea, doza infecție SHC014-MA15 10 4 pfu indus> 10% pierdere în greutate și mortalitate la unele animale in varsta ( Fig. 1 și suplimentar Fig. 3). Am constatat că vaccinarea cu o doză mai mică de SHC014-MA15 (100 pfu), nu a indus pierderea în greutate, dar nu a reușit să protejeze animalele în vârstă de o provocare a dozei letale SARS-MA15 ( Fig. 6e, f ). Împreună, datele sugerează că provocarea SHC014-MA15 poate conferi protecție încrucișată împotriva SARS-CoV prin epitopuri conservate, dar doza necesară induce patogeneză și împiedică utilizarea ca vaccin atenuat.

După ce am stabilit că vârful SHC014 are capacitatea de a media infecția celulelor umane și de a provoca boli la șoareci, am sintetizat în continuare o clonă infecțioasă SHC014-CoV pe toată lungimea bazată pe abordarea folosită pentru SARS-CoV ( Fig. 3a ) 2 . Replicarea în celulele Vero nu a evidențiat niciun deficit pentru SHC014-CoV în raport cu cel pentru SARS-CoV ( Fig. 3b ); cu toate acestea, SHC014-CoV a fost semnificativ atenuat ( P <0.01) în culturile HAE primare atât la 24 cât și la 48 de ore după infecție ( Fig. 3c ). Infecția in vivo a șoarecilor nu a demonstrat pierderi în greutate semnificative, dar a prezentat o replicare virală redusă la plămâni cu infecție totală SHC014-CoV, în comparație cu SARS-CoV Urbani ( Fig. 3d, e). Împreună, rezultatele stabilesc viabilitatea SHC014-CoV cu lungime întreagă, dar sugerează că este necesară o adaptare suplimentară pentru replicarea acesteia să fie echivalentă cu cea a SARS-CoV epidemică la nivelul celulelor respiratorii umane și la șoareci.

Figura 3: replici SHC014-CoV de lungime completă în căile respiratorii umane, dar nu are virulența epidemiei SARS-CoV.
Figura 3

( a ) Schema clonei moleculare SHC014-CoV, care a fost sintetizată ca șase ADNc contigue (denumite SHC014A, SHC014B, SHC014C, SHC014D, SHC014E și SHC014F), flancate de site-uri BglI unice care permit asamblarea dirijată a expresiei cDNA cu lungime completă cadre de lectură deschise (pentru 1a, 1b, spike, 3, plic, matrice, 6–8 și nucleocapsid). Nucleotidele subliniate reprezintă secvențele suprapuse formate după clivarea enzimei de restricție. ( b , c ) Replicarea virală a SARS-CoV Urbani (negru) sau SHC014-CoV (verde) după infecția celulelor Vero ( b ) sau a culturilor de celule HAE cu interfață primară bine-diferențiată, bine-diferențiată ( c) la un MOI de 0,01. Probele au fost colectate la momente individuale cu replici biologice ( n = 3) pentru fiecare grup. Datele reprezintă un experiment atât pentru celulele Vero, cât și pentru celulele HAE. ( d , e ) Pierderea în greutate ( n = 3 pentru SARS-CoV MA15, n = 7 pentru SHC014-CoV; n = 6 pentru SARS-Urbani) ( d ) și replicarea virală în plămâni ( n = 3 pentru SARS-Urbani și SHC014-CoV) ( e ) din 10 săptămâni a șoarecilor BALB / c infectate cu 1 x 10 5 pfu de SARS-CoV MA15 (gri), SHC014-CoV (verde) sau SARS-CoV Urbani (negru) prin în traseu. Fiecare punct de date reprezintă media grupului, iar barele de eroare definesc sem **P <0,01 și *** P <0,001 folosind testul t Student cu două cozi .

În timpul epidemiei SARS-CoV, s-au stabilit rapid legături între civetele de palmier și tulpinile de CoV care au fost detectate la om 4 . Bazându-se pe această constatare, paradigma comună a apariției susține că SARS-CoV epidemică a apărut ca virus bat, a sărit în civete și a încorporat modificări în domeniul de legare al receptorului (RBD) pentru a îmbunătăți legarea la civetul Ace2 (ref. 18 ). Expunerea ulterioară la oameni pe piețele animalelor vii a permis infecția umană cu tulpina de civet, care, la rândul ei, s-a adaptat pentru a deveni tulpina epidemică ( Fig. 4a ). Cu toate acestea, analiza filogenetică sugerează că tulpinile SARS umane timpurii apar mai strâns legate de tulpinile de lilieci decât de tulpinile de civet 18. Prin urmare, o a doua paradigmă susține că transmisia directă a liliacul-om a inițiat apariția SARS-CoV și că civetele de palmier au servit ca gazdă secundară și rezervor pentru infecția continuă ( Fig. 4b ) 19 . Pentru ambele paradigme, adaptarea vârfului la o gazdă secundară este văzută ca o necesitate, cu cele mai multe mutații așteptate să apară în cadrul RBD, facilitând astfel o infecție îmbunătățită. Ambele teorii implică faptul că grupurile de CoV-uri ale liliecilor sunt limitate și că mutațiile din gama gazdă sunt atât aleatorii, cât și rare, reducând probabilitatea apariției unor evenimente viitoare la om.

Figura 4: Paradigme de emergență pentru coronavirusuri.
figure4

Tulpinile de coronavirus sunt menținute în bazine cvasispecie care circulă în populațiile de lilieci. ( a , b ) Teoriile tradiționale de apariție a SARS-CoV consideră că mutanții din gama gazdă (cercul roșu) reprezintă apariții aleatorii și rare care permit infecția gazdelor alternative. Paradigma-gazdă secundară ( a ) susține că o gazdă non-umană este infectată de un virus progenitor de lilieci și, prin adaptare, facilitează transmiterea la om; replicarea ulterioară la om duce la tulpina virală epidemică. Paradigma directă ( b) sugerează că transmiterea are loc între lilieci și oameni, fără a fi necesară o gazdă intermediară; selecția are loc apoi în populația umană, cu viruși strâns în legătură cu replicarea la o gazdă secundară, permițând persistența virală continuă și adaptarea în ambele. ( c ) Datele de viruși himerici similari cu SARS susțin că grupurile cvasispecie mențin mai mulți viruși capabili să infecteze celulele umane fără a fi nevoie de mutații (cercuri roșii). Deși pot fi necesare adaptări la gazdele secundare sau umane pentru apariția epidemiei, dacă virușii conținând spike SHC014 recombinați cu coloane vertebrale de CoV (cercuri cu contururi verzi), atunci boala epidemică poate fi rezultatul la oameni. Elemente de suport existente pentru date din toate cele trei paradigme.

Deși studiul nostru nu invalidează celelalte rute de apariție, ea susține o a treia paradigmă în care piscinele circulare de CoV de lilieci păstrează proteine ​​spice „în stare”, capabile să infecteze oamenii fără mutație sau adaptare ( Fig. 4c ). Această ipoteză este ilustrată de capacitatea unui virus himeric care conține vârful SHC014 într-o coloană vertebrală SARS-CoV de a provoca o infecție robustă atât în ​​culturile căilor respiratorii umane, cât și la șoareci fără adaptare la RBD. Împreună cu observarea unor coloane 3 , 20 patogene CoV identificate anterior, rezultatele noastre sugerează că materialele de pornire necesare pentru tulpinile emergente asemănătoare SARS circulă în prezent în rezervoarele de animale. În special, deși SHC014-CoV cu lungime completă necesită probabil o adaptare suplimentară a coloanei vertebrale la mediarea bolilor umane, evenimentele de recombinare documentate de înaltă frecvență la familiile CoV subliniază posibilitatea apariției viitoare și necesitatea unei pregătiri suplimentare.

Până în prezent, ecranele genomice ale populațiilor de animale au fost utilizate în principal pentru a identifica viruși noi în setările de focar 21. Abordarea aici extinde aceste seturi de date pentru a examina întrebările legate de apariția virală și eficacitatea terapeutică. Considerăm că virușii cu vârful SHC014 reprezintă o potențială amenințare datorită capacității lor de a se reproduce în culturile căilor respiratorii umane primare, cel mai bun model disponibil pentru boala umană. În plus, patogeneza observată la șoareci indică o capacitate pentru virusurile care conțin SHC014 de a provoca boala la modelele de mamifere, fără adaptare la RBD. În special, tropismul diferențial în plămâni, comparativ cu cel cu SARS-MA15 și atenuarea SHC014-CoV de lungime întreagă în culturile HAE în raport cu SARS-CoV Urbani sugerează că factori care depășesc legarea ACE2 - inclusiv procesivitatea spike, bio-disponibilitatea receptorului sau antagonismul dintre răspunsurile imune ale gazdei - pot contribui la apariție. In orice caz, testarea ulterioară a primatelor non-umane este necesară pentru a transpune aceste descoperiri în potențial patogen la om. Important de important, eșecul terapeuticii disponibile definește o necesitate critică pentru studii suplimentare și pentru dezvoltarea tratamentelor. Cu aceste cunoștințe, pot fi produse programe de supraveghere, reactivi de diagnosticare și tratamente eficiente care sunt de protecție împotriva apariției CoV-urilor specifice grupului 2b, cum ar fi SHC014, iar acestea pot fi aplicate la alte sucursale ale CoV care mențin grupuri similare eterogene.

Pe lângă oferirea pregătirii împotriva viitoarelor viruși emergente, această abordare trebuie să fie luată în considerare în contextul unei pauze impuse de guvernul SUA privind studiile câștigului de funcție (GOF) 22 . Pe baza modelelor anterioare de apariție ( fig. 4a, b ), creșterea virușilor himerici precum SHC014-MA15 nu era de așteptat să crească patogenitatea. Deși SHC014-MA15 este atenuat în raport cu SARS-CoV-ul parental adaptat la șoareci, studii similare care examinează patogenitatea CoV-urilor cu vârful Urbani de tip sălbatic în coloana vertebrală MA15 nu au arătat pierderi în greutate la șoareci și replicare virală redusă 23 . Astfel, în raport cu vârful Urbani - MA15 CoV, SHC014-MA15 arată un câștig în patogeneză ( Fig. 1). Pe baza acestor constatări, panourile de revizuire științifică pot considera studii similare care creează virusuri himerice bazate pe tulpini circulante prea riscante pentru a urmări, deoarece patogenitatea crescută la modelele de mamifere nu poate fi exclusă. Împreună cu restricțiile la tulpinile adaptate la șoareci și dezvoltarea anticorpilor monoclonali care utilizează mutanți de evadare, cercetarea apariției CoV și eficacitatea terapeutică pot fi puternic limitate înainte. Împreună, aceste date și restricții reprezintă o răscruce a problemelor de cercetare ale FG; trebuie cântărit potențialul de a pregăti și de a atenua viitoarele focare împotriva riscului de a crea agenți patogeni mai periculoși. În elaborarea politicilor care avansează,

În general, abordarea noastră a utilizat datele metagenomice pentru a identifica o potențială amenințare prezentată de CoV SHC014, precum șarpele circulant de tip SARS. Datorită capacității virusurilor himerice SHC014 de a se reproduce în culturile căilor respiratorii umane, de a provoca patogeneză in vivo și de a scăpa de terapeutica curentă, este nevoie de atât supraveghere, cât și terapeutică îmbunătățită împotriva virusurilor circulante asemănătoare SARS. Abordarea noastră deblochează, de asemenea, utilizarea datelor metagenomice pentru a prezice apariția virală și pentru a aplica aceste cunoștințe în pregătirea pentru tratarea viitoarelor infecții cu virus emergent.

metode

Virusi, celule, infectii in vitro si analize de placa.

SARS-CoV (Urbani) de tip sălbatic, SARS-CoV (MA15) adaptat la șoarece și CoV-uri chimice de tip SARS au fost cultivate pe celulele Vero E6 (obținute de la Institutul de Cercetări Medicale ale Armatei din Statele Unite ale bolilor infecțioase), cultivate în Eagle's modificat de Dulbecco mediu (DMEM) (Gibco, CA) și 5% ser clon fetal (FCS) (Hyclone, South Logan, UT) împreună cu antibiotice / antimicotice (Gibco, Carlsbad, CA). Celulele DBT (laborator Baric, sursa necunoscută) care exprimă ortologii ACE2 au fost descrise anterior atât pentru om cât și pentru civet; Secvența de liliac Ace2 s-a bazat pe cea de la Rhinolophus leschenaulti , iar celulele DBT care exprimă liliezul 2 au fost stabilite așa cum s-a descris anterior 8. Experimentele de pseudotipare au fost similare cu cele care foloseau un pseudovirus bazat pe HIV, preparate după cum s-a descris anterior 10 și examinate pe celulele HeLa (Institutul de Virologie Wuhan) care exprimau ortologii ACE2 . Celulele HeLa au fost cultivate într-un mediu esențial minim (MEM) (Gibco, CA) suplimentat cu FCS 10% (Gibco, CA), așa cum s-a descris anterior 24 . Curbele de creștere în Vero E6, DBT, Calu-3 2B4 și celule epiteliale ale căilor respiratorii umane primare au fost efectuate așa cum s-a descris anterior 8 , 25. Niciunul dintre stocurile de linie celulară nu a fost autentificat sau testat pentru micoplasmă recent, deși stocurile de semințe originale utilizate pentru a crea stocurile de lucru nu sunt contaminate. Plămânii umani pentru culturile HAE au fost procurați în cadrul protocoalelor aprobate de Universitatea din Carolina de Nord la Chapel Hill Institutional Review Board. Culturile HAE reprezintă epiteliu al căilor respiratorii umane extrem de diferențiate, care conține celule epiteliale ciliate și ne-ciliate, precum și celule goblet. Culturile sunt, de asemenea, cultivate pe o interfață aer-lichid timp de câteva săptămâni înainte de utilizare, așa cum s-a descris anterior 26. Pe scurt, celulele au fost spălate cu PBS și inoculate cu virus sau diluate cu machet în PBS timp de 40 min la 37 ° C. După inoculare, celulele au fost spălate de trei ori și s-a adăugat mediu proaspăt pentru a semnifica timpul „0”. Au fost recoltate trei sau mai multe replici biologice la fiecare moment descris. Nu s-a utilizat nicio orbire în colecțiile de probe și nici nu s-au randomizat probe. Toată cultivarea virusului s-a efectuat într-un laborator de nivel biosecuritate (BSL) 3 cu ventilatoare redundante în cabinetele de biosiguranță, așa cum a fost descris anterior de grupul nostru 2 . Tot personalul purta respiratoare de purificare a aerului (Breathe Easy, 3M), cu costume Tyvek, șorțuri și cizme și erau duble.

Clustering de secvență și modelare structurală.

Secvențele genomice de lungime completă și secvențele de aminoacizi din domeniile S1 ale vârfului CoV-urilor reprezentative au fost descărcate de la Genbank sau Pathosystems Resource Integration Center (PATRIC), aliniate cu ClustalX și comparate filogenetic folosind estimarea probabilității maxime folosind 100 de bootstraps sau de folosind PhyML ( https://code.google.com/p/phyml/) pachet, respectiv. Arborele a fost generat folosind probabilitatea maximă cu pachetul PhyML. Bara de scară reprezintă substituții de nucleotide. Doar nodurile cu suport pentru bootstrap peste 70% sunt etichetate. Arborele arată că CoV-urile sunt împărțite în trei grupări filogenetice distincte definite ca α-CoVs, β-CoVs și γ-CoVs. Grupurile de subgrupuri clasice sunt marcate ca 2a, 2b, 2c și 2d pentru β-CoV și 1a și 1b pentru α-CoVs. Modelele structurale au fost generate utilizând Modeller (Max Planck Institute Bioinformatics Toolkit) pentru a genera modele de omologie pentru SHC014 și Rs3367 ale SARS RBD în complex cu ACE2 bazate pe structura de cristal 2AJF (Protein Data Bank). Modelele de omologie au fost vizualizate și manipulate în MacPyMol (versiunea 1.3).

Construirea virușilor himerici asemănători SARS.

Atât virusurile de tip sălbatic, cât și himerice au fost derivate fie din SARS-CoV Urbani, fie din clona infecțioasă (SARS-CoV MA15) adaptată la șoarece (ic), descrisă anterior 27 . Plasmidele care conțin secvențe spike pentru SHC014 au fost extrase prin digerare de restricție și ligate în plasmida E și F din clona infecțioasă MA15. Clona a fost proiectată și achiziționată de la Bio Basic ca șase ADNc contigue folosind secvențe publicate flancate de site-uri unice de restricție de endonuclează de clasă II (BglI). După aceea, plasmidele care conțin fragmente genomice de tip sălbatic, SARS-CoV și SHC014-CoV au fost amplificate, excizate, ligate și purificate. Reacțiile de transcriere in vitro au fost apoi preformate pentru a sintetiza ARN genomic de lungime completă, care a fost transfectat în celule Vero E6 așa cum s-a descris anterior2 . Mediul din celulele transfectate a fost recoltat și a servit ca stocuri de semințe pentru experimentele ulterioare. Virusii chimerici și cu lungime completă au fost confirmați prin analiza secvenței înainte de utilizare în aceste studii. Construcția sintetică a mutantului himeric și a întregii SHC014-CoV a fost aprobată de Comitetul instituțional de biosiguranță al Universității din Carolina de Nord și de Comitetul de Cercetare pe Utilizare Duală a Preocupării.

Declarație de etică.

Acest studiu a fost realizat în conformitate cu recomandările pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de către Oficiul pentru Protecția Animalelor de Laborator (OLAW), NIH. Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) al Universității din Carolina de Nord din Chapel Hill (UNC, numărul de permis A-3410-01) a aprobat protocolul de studiu animal (IACUC # 13-033) utilizat în aceste studii.

Șoareci și infecție in vivo .

Șoarecii BALB / cAnNHsD, de 10 săptămâni și 12 luni, au fost comandați de la Laboratoarele Harlan. Infecțiile cu șoareci au fost efectuate așa cum s-a descris anterior 20. Pe scurt, animalele au fost aduse într-un laborator BSL3 și lăsate să se aclimatizeze timp de 1 săptămână înainte de infecție. Pentru infecție și vaccinare antivirus atenuată, șoarecii au fost anesteziați cu un amestec de ketamină și xilazină și infectați intranazal, atunci când au fost provocați, cu 50 µl de soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) sau virus diluat cu trei sau patru șoareci pe moment, per grup de infecție pe doză, așa cum este descris în legendele din figură. Pentru șoarecii individuali, notările pentru infecție, inclusiv eșecul inhalării întregii doze, balonarea inoculului din nas sau infecția prin gură ar fi putut duce la excluderea datelor la șoareci, la discreția cercetătorului; post-infecție, nu sunt definite alte criterii prestabilite de excludere sau includere. Nu s-a folosit nicio orbire în experimentele cu animale, iar animalele nu au fost randomizate. Pentru vaccinare, Șoarecii tineri și vârstnici au fost vaccinați prin injecție cu pachet de picior cu un volum de 20 μl fie de 0,2 μg de vaccin dublu-inactivat SARS-CoV cu PBS de alum sau mock; șoarecii au fost apoi stimulați cu același regim 22 d mai târziu și au fost provocați 21 d după aceea. Pentru toate grupele, conform protocolului, animalele au fost monitorizate zilnic pentru semne clinice de boală (vânat, blană înfundată și activitate redusă) pe durata experimentului. Pierderea în greutate a fost monitorizată zilnic pentru primele 7 d, după care monitorizarea în greutate a continuat până când animalele s-au recuperat la greutatea inițială inițială sau au afișat creșterea în greutate continuu timp de 3 zile. Toți șoarecii care au pierdut mai mult de 20% din greutatea lor corporală inițială au fost hrăniți la sol și monitorizați în continuare de mai multe ori pe zi, atât timp cât au fost sub limita de 20%. Șoarecii care au pierdut mai mult de 30% din greutatea lor corporală inițială au fost imediat sacrificați conform protocolului. Orice șoricel considerat moribund sau puțin probabil să se recupereze a fost, de asemenea, sacrificat uman, la discreția cercetătorului. Eutanasia a fost efectuată folosind o supradozaj cu izofluran și moartea a fost confirmată prin luxație cervicală. Toate studiile la șoarece au fost efectuate la Universitatea din Carolina de Nord (Animal Welfare Assurance # A3410-01) folosind protocoale aprobate de UNC Institutional Care Care and Use Animal Committee (IACUC).

Analiza histologică.

Plămânul stâng a fost îndepărtat și scufundat în formalină tamponată cu 10% (Fisher) fără inflație timp de 1 săptămână. Țesuturile au fost înglobate în parafină și secțiuni de 5 μm au fost preparate de facilitatea de bază a histopatologiei Centrului de Cancer Comprehensive Cancer UNC Lineberger. Pentru a determina gradul de colorare a antigenului, secțiunile au fost colorate pentru antigenul viral folosind un anticorp anti-nucleocapsid policlinic SARS-CoV disponibil în comerț (Imgenex) și s-au marcat în mod orb, pentru colorarea căilor respiratorii și a parenchimului descris anterior 20 . Imaginile au fost surprinse folosind un microscop Olympus BX41 cu o cameră foto Olympus DP71.

Analize de neutralizare a virusului.

Testele de neutralizare a reducerii plăcii au fost efectuate cu anticorpi caracterizați anterior împotriva SARS-CoV, așa cum s-a descris anterior 11 , 12 , 13 . Pe scurt, neutralizarea anticorpilor sau a serului a fost diluată serial de două ori și s-a incubat cu 100 pfu din diferitele tulpini infecțioase de tip SARS-CoV pentru o oră la 37 ° C. Virusul și anticorpii au fost apoi adăugați pe o placă cu 6 godeuri cu 5 × 10 5 celule Vero E6 / godeu cu multiple replici ( n≥ 2). După o incubare de 1 h la 37 ° C, celulele au fost suprapuse cu 3 ml de agaroză 0,8% în mediu. Plăcile au fost incubate timp de 2 d la 37 ° C, colorate cu roșu neutru timp de 3 ore și plăcuțele au fost numărate. Procentul reducerii plăcii a fost calculat ca (1 - (nr. De plăci cu anticorp / nr. De plăci fără anticorp)) × 100.

Analize statistice.

Toate experimentele au fost efectuate contrastând două grupuri experimentale (fie doi virusuri, fie cohorte vaccinate și nevaccinate). Prin urmare, diferențe semnificative în titrul viral și notarea histologiei au fost determinate de testul t Student cu două cozi la punctele individuale de timp. În mod normal, datele au fost distribuite în fiecare grup fiind comparate și au variat similar.

Biosecuritate și biosecuritate.

Studiile raportate au fost inițiate după ce Comitetul instituțional de biosecuritate al Universității din Carolina de Nord a aprobat protocolul experimental (Titlul proiectului: Generarea clonelor infecțioase ale CoV-urilor de tip SARS pentru lilieci; ID-ul Planului de siguranță al laboratorului: 20145741; ID G Schedule: 12279). Aceste studii au fost inițiate înaintea Pauzei de finanțare a cercetării procesului de deliberare a Guvernului SUA pentru cercetarea selectată în câștig de funcții care implică virusul gripal, MERS și SARS ( http://www.phe.gov/s3/dualuse/Documents/gain-of-function .pdf ). Această lucrare a fost revizuită de agenția de finanțare, NIH. S-a solicitat continuarea acestor studii, iar acest lucru a fost aprobat de către NIH. SARS-CoV este un agent select.

Toate lucrările pentru aceste studii au fost efectuate cu proceduri de operare standard (POS) aprobate și condiții de siguranță pentru SARS-CoV, MER-CoV și alte CoV-uri conexe.

Facilitățile noastre instituționale CoV BSL3 au fost concepute pentru a se conforma cerințelor de securitate recomandate în Biosecuritatea în Laboratoarele Microbiologice și Biomedicale (BMBL), Departamentul Sănătății și Serviciilor Umane din SUA, Serviciul de Sănătate Publică, Centrele pentru Controlul Bolilor (CDC) ) și NIH. Planurile de siguranță de laborator au fost prezentate și instalația a fost aprobată pentru utilizare, de către Departamentul UNC pentru Sănătate și Securitate de Mediu (EHS) și CDC. Accesul cardului electronic este necesar pentru intrarea în instalație. Toți lucrătorii au fost instruiți de EHS să utilizeze în siguranță respiratoare de purificare a aerului (PAPR), și sunt stabilite obiceiuri de muncă adecvate într-o instalație BSL3 și planuri de supraveghere medicală active.

Facilitățile noastre CoV BSL3 conțin ventilatoare redundante, putere de urgență pentru ventilatoare și dulapuri și congelatoare biologice, iar facilitățile noastre pot găzdui rafturi pentru șoarece SealSafe. Materialele clasificate ca agenți BSL3 constau din SARS-CoV, tulpini precursoare ale ratelor de mână, MERS-CoV și mutanți derivați de la acești agenți patogeni. În cadrul instalațiilor BSL3, experimentarea cu virus infecțios se efectuează într-un cabinet certificat de securitate biologică de clasa II (BSC). Toți membrii personalului poartă scrubs, costume și șorțuri Tyvek, PAPR-uri și huse pentru pantofi, iar mâinile lor sunt dublate. Utilizatorii de BSL3 sunt supuși unui plan de supraveghere medicală monitorizat de către Clinica de Sănătate a Muncii din cadrul Angajatului Universitar (UEOHC), care include un anual fizic vaccinarea antigripală anuală și raportarea obligatorie a oricăror simptome asociate cu infecția cu COV în perioadele în care lucrează în BSL3.

Toți utilizatorii BSL3 sunt instruiți în gestionarea expunerii și protocoale de raportare, sunt pregătiți să se auto-carantineze și au fost instruiți pentru livrare în siguranță la un departament local de gestionare a bolilor infecțioase în situații de urgență. Toate evenimentele potențiale de expunere sunt raportate și investigate de EHS și UEOHC, cu rapoarte depuse atât la CDC cât și la NIH.

Istoricul schimbărilor

30 martie 2020
Nota redactorilor, martie 2020: Suntem conștienți că acest articol este utilizat ca bază pentru teoriile neverificate conform cărora noul coronavirus care cauzează COVID-19 a fost conceput. Nu există dovezi că acest lucru este adevărat; oamenii de știință cred că un animal este sursa cea mai probabilă a coronavirusului.

20 noiembrie 2015
În versiunea acestui articol publicat inițial online, autorii au omis să recunoască o sursă de finanțare, finanțarea USAID-EPT-PREDICT de la EcoHealth Alliance, către Z.-LS Eroarea a fost corectată pentru versiunile tipărite, PDF și HTML ale acestui articol .


(Fluierul)


Linkul direct catre Petitie

CEREM NATIONALIZAREA TUTUROR RESURSELOR NATURALE ALE ROMANIEI ! - Initiativa Legislativa care are nevoie de 500.000 de semnaturi - Semneaza si tu !

Comentarii:

  • Oculta Satanica  Albert Desalvo   2020-04-12 - 23:46

    Intr-adevar nu incape indoiala ca acest Coronavirus(denumirea stiintifica, fiind sars-cov 2) este 100% un virus artificial fabricat in laborator, una dintre expicatii fiind aceea ca el contine gene de HIV, lucru imposibil la virus ce da sindrom respirator acut! Acest fapt este confirmat si de majoritatea marilor virusologi, iar unii dintre acestia il considera o adevarata arma biologica ce a fost imprastiata intentionat in intreaga Lume!


Adauga Comentariu



Citiți și cele mai căutate articole de pe Fluierul:

Avionul Egyptair prăbuşit: Analiza uneia din cutiile negre arată că s-a pronunţat cuvântul "foc"

BOMBĂ ActiveNews: "Președintele Klaus Iohannis este membru al Organizației Progresiste 'European Council of Foreign Relations' un Think-Tank fondat de GEORGE SOROS". Fluierul.ro a descoperit că ECFR e condusă de Carl Bildt MEMBRU AL GRUPULUI BILDERBERG

DEZVĂLUIRI / Securiștii tranziției – Azi, generalul Dan Gheorghe, fost colonel USLA, "unchiul lui Coldea"

FLUIERUL A AVUT DREPTATE. BEBELUȘII S-AU ÎMBOLNĂVIT DE LA VACCINURI. Corpul de control al Guvernului a sesizat Parchetul în cazul copiilor cu SHU. "La 17 bebelușilor îmbolnăviți le fuseseră administrate anterior vaccinul hexavalent şi alte vaccinuri"

Carantina selectivă provoacă proteste violente la Madrid. Cetățenii din cartierele periferice se simt discriminați de noile reguli

ULTIMUL CAP DIN ROMÂNIA. Nu şi-au vândut pământul la străini, nu şi-au distrus sistemele de irigații. Ultimul CAP din România plăteşte tractoriştii cu 2000 de euro şi are in fiecare an profit de cel puțin un milion de euro

O fostă majoretă a făcut SEX cu un elev de 15 ani! Filmul XXX a ajuns pe INTERNET. VIDEO

Dupa 26 de ani de capitalism. Datoria tarii a crescut de la ZERO la 96 de miliarde, nou-nascutii au scazut de la 314.000 la 185.000, consumul de carne a scazut cu 4%, locurile de munca s-au injumatatit de la 8.2 la 4.6 mil., pensionarii au crescut cu 40%

Imagini XXX. Cine este vedeta surprinsă aproape goală la plajă

Vor reuși midiile românești să le înlocuiască pe cele bulgărești din restaurante? "În plin sezon vindem 800-1000 kg de scoici"

Fata unui primar din Timiş, care a provocat un accident rutier, atacă dur ziariştii

Ion Cristoiu: Duminică seara, Nicușor Dan nu va fi primarul bucureștenilor, ci al lui Klaus Iohannis!

Un Studiu Medical din 2014 publicat în celebra revistă BioMed Central, studiu care arată legătura între Autism şi Vaccinul anti-rujeolă-oreion-rubeolă, a fost retras

Alegeri locale 2020. Cine candidează pentru funcția de primar în Craiova. Află care este ordinea pe buletinul de vot

Navalnîi postează pe Instagram mesaje de mulțumire. Opozantul lui Putin pozează alături de soție

Din dansatoare de balet a devenit as în gaming. Mari Takahashi și-a făcut o carieră pe YouTube și a participat în reality show-ul Survivor

Propunerea indecentă a unei vedete autohtone pentru o tânără sexy: "Vreau să fac sex în trei cu tine şi cu..."

Voucherele de vacanță oferite de agenții pentru vacanțele anulate: Guvernul vrea să garanteze 100% din valoarea lor

Anisia Gafton, ipostaze de infarct, cu chiloții la vedere. Dezmăț total | VIDEO

VEDETE de la noi, în SCENE EROTICE de mult UITATE! CELE mai TARI NUDURI din filmele românești | FOTO & VIDEO

Două tinere din Botoșani care au plecat spre regiunea Sardinia, din Italia, de negăsit

Analiza Gramaticala - Clasele V - VIII

Alegeri locale 2020. Iași. Primarul Mihai Chirica(PNL) vs. senatoarea Cosette Chichirău (USR PLUS). PSD are a treia șansă. Lista completă

Atac la Paris: 'În mod clar a fost un act de terorism islamist' (ministru de interne)

SUA: Președintele Donald Trump intenționează să o numească la Curtea Supremă pe Amy Coney Barrett (CNN)

Studenții la Drept dau jumătate de salariu pe cărți. Costurile depășesc 1000 de lei anual

Campionatul Național de Drift are loc azi pe Transalpina care se închide temporar

HOROSCOP 26 SEPTEMBRIE: Patru zodii nu sunt văzute bine de astre azi. Doar una reintră în grațiile lor

NASA nu-și poate da seama de ce stația spațială internațională pierde aer

DEZVĂLUIRE / Încălcînd Constituția și mai multe legi în vigoare, IICCMER a trecut la secretizarea crimelor comunismului (II) | DOCUMENT - Acordul de confidențialitate

MOSTENIREA nestiuta a lui Ceausescu! America e SOCATA de ce a descoperit in Romania
ULTIMA ORA: Dusmanii tarii vor sa ascunda adevarul

Cea mai sexy dansatoare amatoare. O tânără a înebunit internetul cu un DANS EROTIC VIDEO

Ferrari a prezentat modelul Omologata, singurul creat de către inginerii italieni. Care sunt trăsăturile mașinii unice în lume

FOTO-VIDEO Inundații în județul Hunedoara. Drumul s-a surpat, rețeaua electrică este avariată

Un șobolan uriaș african, antrenat să detecteze mine terestre, a fost decorat cu medalia de aur pentru vitejie. Fă cunoștiință cu Magawa

Un studiu al Universității din București contrazice parțial OMS. Ce spune ANPC despre transmiterea SARS-CoV-2 prin alimente

COMENTARIU Lelia Munteanu: "Următorul Dragnea de la PNL vine"

CFR Călători suplimentează trenurile de dormit și cu cușetă pentru pelerinajul de Sf. Parascheva

Tenis: Serena Williams nu se gândește la retragere

Fotbal/Coronavirus: Meciul Unirea Slobozia - Farul, amânat din cauza unor teste pozitive la constănțeni

Vâlcea: Trafic rutier blocat pe DN7, la Călinești, în urma unui accident

Vot în COVID. Cum pot vota alegătorii care se afă în carantină

Tânăr împușcat cu un pistol cu bile după un conflict spontan în Capitală

CITATUL ZILEI

Adio 5G, trăiască 6G. Noua tehnologie va fi disponibilă din 2030

O fetiță de 12 ani, din Cehia, a reușit să prindă hackerii care au furat până la 500.000 de dolari

Organizația Mondială a Sănătății avertizează: Decesele la nivel mondial ar putea atinge două milioane înainte de utilizarea pe scară largă a vaccinului

Alegeri locale 2020. Cine sunt candidații la Primăria Capitalei și primăriile de Sectoare. LISTA COMPLETĂ

Conor McGregor revine în ringul de box. Pe cine va avea ca oponent

CAMPANIA ALEGE SMART Ce-i lipsește orașului Târgu Jiu ca să aibă calitatea unui oraș nemțesc

Cod portocaliu de ploi abundente și vijelii în 30 de județe

COVID 19 a crescut numărul tinerilor și al cadrelor medicale cu depresie

Alegeri locale 2020. Cine candidează pentru funcția de primar la Cluj Napoca. Prezența la ultimul scrutin

Cine este Anamaria Gudu, noua prezentatoare de la Observator

Fotbal - Liga I: FC Argeș - Universitatea Craiova 1-2

Vali Vijelie, prins de soţie la amantă. Femeia înşelată a spart geamurile casei unde se aflau amorezii FOTO

Peru: Autoritățile redeschid frontierele aeriene din 5 octombrie

Sprâncenele naturale sunt tot mai căutate. Noul trend evidențiază mai bine trăsăturile feței

Auto: Simone Tempestini a cucerit un nou titlu de campion național de raliuri

"SOLUȚIA" LUI SOROS LA CRIZA COVID. Soros vrea ca țările UE să elibereze Titluri de Stat Perpetue pentru ca popoarele UE să plătească VEȘNIC, 5 miliarde de euro dobândă în FIECARE an. Asta l-a dus mintea de speculant pe SOROS.


Pag.1 Pag.2 Pag.3 Pag.4 Pag.5 Pag.6 Pag.7
Pag.8 Pag.9

Nr. de articole la aceasta sectiune: 533, afisate in 9 pagini.