Abstract

Degradarea declanșată de fosforilare este o strategie comună pentru eliminarea proteinelor reglatoare în multe procese importante de semnalizare celulară. Printre exemplele interesante se numără inhibitorii kinazei dependenți de ciclina, cum ar fi p27 în om și Sic1 în drojdie, care joacă roluri cruciale în timpul tranziției G1 / S în ciclul celular. În această lucrare am modelat și analizat sistematic dinamica degradării proteinei declanșate de fosforilarea multisitelor. Inspirat de observațiile experimentale asupra proteinei Sic1 și de o conjectură teoretică intuitivă anterioară, dezvoltăm un model care să examineze în detaliu dinamica degradării unei proteine ​​care conține situsuri multiple de fosforilare și un număr al sitului de prag pentru eliminarea ca răspuns la semnalul kinazei. Modelul nostru explică rolul siturilor de fosforilare multiple, comparativ cu un singur sit, în reglarea degradării proteinelor. O proteină cu un singur sit nu poate converti o intrare gradată a creșterii kinazei la o ieșire mult mai clară, în timp ce fosforilarea multisită este capabilă să genereze un profil temporal foarte asemănător cu cel al substratului cu două caracteristici: pragul temporal și scăderea rapidă dincolo de prag. Introducem o măsură numită coeficient de răspuns temporal pentru a cuantifica măsura în care un răspuns în domeniul temporal se schimbă și pentru a investiga în continuare modul în care această proprietate este determinată de diferiți factori, inclusiv intrarea kinazei, numărul total de site-uri, pentru eliminare, ordinea fosforilării, parametrii cinetici și preferința site-ului. Unele predicții interesante și verificabile din punct de vedere experimental includ faptul că fracția nedegradabilă a proteinei substratului prezintă un profil temporal mai mult ca un comutator; un sistem secvențial este mai asemănător unui comutator, în timp ce un sistem aleatoriu are avantajul unei robustețe sporite; toți parametrii, inclusiv numărul total de situri, numărul de puncte pentru eliminare și parametrii cinetici determină în mod sinergie măsura exactă în care profilul de degradare este similar. Rezultatele noastre sugerează principii de proiectare pentru comutatoarele de degradare a proteinelor, care ar putea fi un mecanism extins pentru o reglare precisă a proceselor celulare, cum ar fi progresia ciclului celular. inclusiv numărul total al siturilor, numărul de puncte pentru eliminare și parametrii cinetici determină în mod sinergie măsura în care profilul de degradare este similar. Rezultatele noastre sugerează principii de proiectare pentru comutatoarele de degradare a proteinelor, care ar putea fi un mecanism extins pentru o reglare precisă a proceselor celulare, cum ar fi progresia ciclului celular. inclusiv numărul total al siturilor, numărul de puncte pentru eliminare și parametrii cinetici determină în mod sinergie măsura în care profilul de degradare este similar. Rezultatele noastre sugerează principii de proiectare pentru comutatoarele de degradare a proteinelor, care ar putea fi un mecanism extins pentru o reglare precisă a proceselor celulare, cum ar fi progresia ciclului celular.

Introducere

O treime din toate proteinele din celulele eucariote sunt fosforilate în orice moment [1] . Profilul de fosforilare a fost interpretat ca un "cod de bare molecular" [2] pentru a direcționa proteinele pentru alte procese, cum ar fi activarea, inactivarea, translocarea și degradarea. În special, trei tranziții majore în ciclul celular, și anume intrarea în faza S, separarea cromatidelor sora și ieșirea din mitoză implică degradarea anumitor proteine ​​după ubiquitinizarea dependentă de fosforilare [3] - [5] . Ubiquitinizarea condusă de fosforilare prin calea SCF și degradarea proteazomală ulterioară au fost considerate ca un comutator biochimic crucial pentru coordonarea modificărilor de fază în timpul ciclului celular [6] ,[7] . De exemplu, ubiquitinizarea și degradarea Sic1, un inhibitor al kinazei dependentă de ciclin în drojdie și omologul său funcțional în celulele mamifere, p27, sunt declanșate prin fosforilare [8] - [11] . Degradarea Sic1 și p27 conduce la eliberarea de cicline necesare pentru sinteza ADN în faza S. P27 nucleare redusă este observată la până la 60% din cazurile de cancer mamar primar, care a fost corelată cu creșterea activității familiei Src kinazelor [12] .

Numărul locurilor de fosforilare observate într-o singură proteină poate varia de la 1 la peste 100 [13] . A devenit din ce în ce mai evident faptul că fosforilarea multisită este un fenomen larg răspândit printre proteinele reglatoare în celulele eucariote. Protecția fosforilației multilite oferă potențial un instrument precis pentru reglarea dinamică a procesului din aval. Diferitele profiluri de fosforilare ale unei singure proteine ​​ar putea fi legate de diferite funcții. De exemplu, proteina de retinoblastom (Rb) are 16 Ser / Thr-Pro situri de fosforilare și interacționează cu diferite proteine în timpul diferitelor faze ale ciclului celular în funcție de profilul său de fosforilare [14] , [15]. Mai ales, la începutul lui G1, Rb este hipofosforilat și sechestrează familia E2F a factorilor de transcripție, împiedicând astfel transcrierea genelor necesare pentru intrarea în fază S; în timp ce în G1 târziu, Rb devine hiperfosforilat și astfel inactiv în reprimarea tranziției G1 / S [16] . Ca un alt exemplu, două situsuri din proteina Xenopus Wee1A sunt responsabile pentru inactivarea mitotică a acestei proteine, în timp ce cel puțin două alte reglează proteoliza în timpul interfazei [17]. În mod intrigant, în ceea ce privește stabilitatea proteinei, o proprietate alternativă a fosforilării multisite, gradul de fosforilare (adică numărul de grupări fosfat pe o proteină), în loc de modelul exact, ar putea determina soarta proteinei. Un exemplu bine studiat este proteina Sic1, care joacă un rol cheie în reglarea tranziției G1 / S în ciclul celular al Saccharomyces cerevisiae .

Sic1 inhibă kinaza Clb5, 6-Cdc28 necesară pentru replicarea ADN și se crede că asigură o temporizare precisă pentru tranziția G1 la S prin supunerea la o degradare mediată de proteazom cum ar fi trecerea prin fosforilare prin complexul Cln2-Cdc28 kinază. Tulpinile de drojdie lipsă de Sic1 inițiază replicarea ADN mai devreme și prezintă fază S extinsă [18] , [19] . Pe de altă parte, în cazul unei tulpini mutante , care sunt rezistente la degradare Sic1, celulele experimenteaza lungit fazei G1 într - un fond de tip sălbatic , în alt mod genetic [20] sau stopul fazei G1 în situații mai complexe [8] , [21] . Sic1 este fosforilat de complexul kinazic Cln2-Cdc28 pe nouă resturi Ser / Thr-Pro [8] . Nash și colab.investigat modul în care fosforilarea multisitelor de Sic 1 reglementează ubiquitinizarea și degradarea acesteia [9] . Ei au început cu mutantul Sic1 care nu are toate cele nouă situri de fosforilare și a restabilit siturile unul câte unul în ordinea importanței lor, măsurată prin gradul în care eliminarea unui singur sit afectează cifra de afaceri Sic1. Reintroducerea seriei a cinci site-uri nu a reușit să restabilească legarea Sic1 la Cdc4, o subunitate în ligaza ubiquitin care determină specificitatea țintă sau viabilitatea celulară. În mod surprinzător, re-adăugarea unui al șaselea situs aparent nesemnificativ a restabilit brusc legarea Sic1 cu Cdc4 in vitro și a reînsuflat celulele in vivo. Aceste experimente au arătat clar că există un număr de prag de situri fosforilate necesare pentru a face legarea Sic1 cu Cdc4. Mecanismul de "numărare" care stă la baza acestei interacțiuni digitale dependente de multisite între Sic1 și Cdc4 fosforilat a fost studiat atât teoretic, cât și experimental. Modelarea matematică a sugerat că interacțiunile de cooperare dintre un Sic1 multi-fosforilat dezordonat și un receptor Cdc4 cu un singur sit pot explica pragul de fosforilare observat [22] . Mai mult decât atât, forțele electrostatice cumulative rezultate din grupările fosfatice încărcate negativ au fost propuse ca bază fizică pentru interacțiunea digitală între Sic1 și Cdc4 [23]. Recent, analiza RMN a arătat că Sic1 există într-adevăr într-o stare dezordonată intrinsec și situsurile sale fosforilate multiple interacționează cu situsul receptorului unic al Cdc4 în echilibru dinamic [24] , [25] .

După descoperirea remarcabilă a faptului că Sic1 necesită cel puțin șase situsuri fosforilate pentru a se lega de Cdc4 pentru ubiquitinizare și degradare ulterioară, Nash și colab. sa presupus că acest prag de fosforilare determină în cele din urmă Sic1 să se degradeze în mod tranzitoriu în timpul tranziției G1 / S [9] . Revedind lucrarea seminala de mai sus, Deshaies si Ferrell au conjectat mai exact ca fosforilarea multisitei poate crea praguri temporale [26]. Ei au calculat cursurile de timp pentru distrugerea Sic1 în trei scenarii: distrugerea Sic1 declanșată de o fosforilare rapidă, una lentă sau șase rapidă. Sa sugerat că atunci când sunt necesare șase fosforilare distributive și echivalente, distrugerea Sic1 este inițial foarte lentă atunci când primele cinci situri sunt fosforilate, apoi după o perioadă de întârziere, degradarea se accelerează dramatic. Într-un alt cuvânt, un prag temporal este creat pentru distrugerea Sic1 de la debutul activării Cln-CDK. În mod alternativ, dacă degradarea Sic1 este guvernată de o singură fosforilare, ar fi existat o scădere treptată a cantității de Sic1 fără întârziere. Cadrul de modelare prezentat de Deshaies și Ferrell în această revizuire, deși primitiv, reprezintă o idee foarte interesantă care vizează să facă legătura esențială între Sic1 ' numărul de prag de fosforilare observat până la funcția sa finală de reglare a tranziției G1 / S. Cu toate acestea, au rămas mai multe avertismente. În primul rând, au fost luate în considerare șase fosforilare, în timp ce Sic1 are un total de nouă situri. Restul site-urilor joacă un rol? În al doilea rând, se poate anticipa că exact modul în care kinaza este activată, adică profilul temporal al semnalului kinazei, afectează degradarea proteinei substrat și acest aspect nu a fost discutat. În cele din urmă, nu a fost clar ce determină cantitativ pragul temporal și viteza de degradare. În această lucrare vom încerca să abordăm problemele de mai sus, realizând modelarea matematică sistematică și detaliată pentru a examina modul în care fosforilarea multisitei ar putea conduce la degradarea proteinelor de tip switch-like.

Comportamentele asemănătoare cu comportamentul au fost studiate extensiv în domeniul staționar, unde răspunsul unui sistem biologic (de exemplu cantitatea de oxigen legată de proteina hemoglobinei ca răspuns la schimbarea concentrației de oxigen) prezintă proprietatea foarte interesantă de a tampona fluctuațiile stimulul sub prag și amplificând drastic schimbarea stimulului deasupra pragului. Acest tip de răspuns comutator asemănător în domeniul starea de echilibru a fost denumit „ultrasensitivity“ în literatura de specialitate și o serie de mecanisme au fost propuse pentru a explica sursele sale, inclusiv cooperativity ligand [27] , un efect multi-pas [28] - [30] , saturația enzimelor (de ex., Ultrasensibilitatea de ordin zero) [31] , [32], feedback pozitiv [33] - [36] , cascadă pe mai multe niveluri [37] - [39] , fosforilare multisite [9] , [32] , [40] - [44] și concurența substratului [45] . Aceste studii au generat informații importante privind răspunsurile la starea de echilibru, care adesea corespund testelor experimentale in vitro , cu privire la modul în care apar comportamentele asemănătoare celor de tip switch. Cu toate acestea, ceea ce este esențial pentru multe sisteme, în special in vivoeste curba tranzitorie a stimulului-răspuns, cum ar fi profilul temporal al Sic1 în timpul tranziției G1 / S, în timp ce răspunsurile de tip switch-like în domeniul temporal au fost investigate foarte limitate. Trebuie remarcat faptul că rețeaua de semnalizare a ciclului celular din drojdie a fost examinată foarte extensiv prin modelarea matematică [46] - [49] ; totuși, degradarea macromoleculelor cum ar fi Sic1 a fost modelată cu o singură reacție de fosforilare fără a lua în considerare etapele de fosforilare multiple.

Într-o lucrare anterioară, am arătat că fosforilarea multisitelor este o sursă potențială de reacții la starea de echilibru, cum ar fi comutarea la starea de echilibru; cel mai important, un număr mare de site-uri totale, combinate cu un număr prag intermediar de site-uri pentru modificarea funcționalității substratului, reprezintă un comportament asemănător cu comutarea (manuscris în revizuire). Aici, extinderea studiilor noastre anterioare, investigăm răspunsurile de tip switch-like în domeniul timpului când stabilitatea proteinelor depinde de gradul de fosforilare. Vom prezenta un model pentru a analiza eliminarea declanșată de fosforilare a proteinei substratului ca răspuns la creșterea activității kinazei. Vom arăta cantitativ modul în care diferiți parametri afectează dinamica eliminării proteinelor atunci când degradarea are loc peste un prag de fosforilare. În special, vom explora modul în care măsura în care dinamica degradării este similară este influențată de tipul stimulilor kinazei, de numărul locurilor de fosforilare, de ordinea reacțiilor de fosforilare și de parametrii cinetici. Am dezvoltat modelul în principal bazat pe sistemul Sic1 pentru a dezvălui rolul site-urilor multiple existente în reglementarea distrugerii de tip switch-like a proteinei în timpul tranziției G1 / S. Cu toate acestea, fosforilarea multisită este potențial o sursă largă de degradare a proteinei de tip switch, iar principiile de proiectare descoperite de modelul nostru ar putea fi aplicabile la multe alte proteine ​​de reglare multisite. Am dezvoltat modelul în principal bazat pe sistemul Sic1 pentru a dezvălui rolul site-urilor multiple existente în reglementarea distrugerii de tip switch-like a proteinei în timpul tranziției G1 / S. Cu toate acestea, fosforilarea multisită este potențial o sursă largă de degradare a proteinei de tip switch, iar principiile de proiectare descoperite de modelul nostru ar putea fi aplicabile la multe alte proteine ​​de reglare multisite. Am dezvoltat modelul în principal bazat pe sistemul Sic1 pentru a dezvălui rolul site-urilor multiple existente în reglementarea distrugerii de tip switch-like a proteinei în timpul tranziției G1 / S. Cu toate acestea, fosforilarea multisită este potențial o sursă largă de degradare a proteinei de tip switch, iar principiile de proiectare descoperite de modelul nostru ar putea fi aplicabile la multe alte proteine ​​de reglare multisite.

Rezultate

Un model general care descrie dinamica degradării proteinelor declanșate de fosforilarea multisitelor

Figura 1A ilustrează rețeaua de reacție de fosforilare-defosforilare-degradare a unei proteine ​​ipotetice cusite-uri de fosforilare. Considerăm o singură kinază și o singură fosfatază care acționează asupra substratului. Presupunem că fiecare reacție de fosforilare sau de defosforilare implică o coliziune independentă între enzimă și substrat; adică, reacțiile au loc în mod distributiv. Numărul speciilor fosforilate distinct depinde de ordinea reacțiilor de fosforilare și de defosforilare. Datorită lipsei datelor în cinetica de fosforilare / defosforilare în mai multe etape, în prezent nu este clar dacă există modele majore specifice în diferite sisteme. Prin urmare, în această lucrare, considerăm cel mai general caz în care reacțiile se întâmplă în mod aleatoriu. Într-un alt cuvânt, orice situs nefosforilat (sau fosforilat) poate fi fosforilat (sau defosforilat) în orice moment, indiferent de stările altor situsuri. Datele existente privind timpul de înjumătățire al mutanților Sic1 au sugerat că fosforilarea pe cele mai multe situsuri ale acestei proteine ​​(opt din nouă) ar putea fi în mare parte aleatoare. Noi numim un astfel de sistem unul aleatoriu, în care existădiferite specii fosforilate și există căi distincte pentru trecerea de la starea complet nefosforilată la cea complet fosforilată. Un caz special important apare atunci când kinaza / fosfataza alege oricând un site specific cu 100% părtinire față de celelalte site-uri. În acest caz, reacțiile de fosforilare / defosforilare se desfășoară într-un mod complet ordonat, așa cum se arată în figura 1B . Există dovezi că anumite proteine ​​sunt supuse fosforilării în astfel de moduri secvențiale. De exemplu, -catetinul, o proteină asociată cu cadherina din Mammalia , este fosforilată de către kinaza Gsk3 pe trei situsuri secvențial în timpul tranziției G2 / M-G1 [50] . Astfel de sisteme sunt denumite secvențiale aici, care simplifică diferite specii fosforilate și o singură cale dreaptă de la starea nefosforilată la cea complet fosforilată.

miniatură
Figura 1. Degradarea declanșată de fosforilare a unei proteine ​​multisite.

(A) O singură kinază și o singură fosfatază acționează asupra unei proteine ​​a locului în ordine aleatorie. Fiecare oval reprezintă o stare distinct fosforilată a proteinei substratului S și indicele indică dacă fiecare loc este sau nu fosforilat (de exemplu, 10100 înseamnă că fosforilarea locurilor 1 și 3 din cele 5 sunt fosforilate). Proteina devine degradabilă (evidențiată în roșu) dacă mai multe situri sunt fosforilate. (B) Cazul special al unui sistem complet secvențial. Superscriptul lui S indică câte site-uri sunt fosforilate. Parametrii (C) cinetici pentru fosforilarea secvențială și defosforilare: , și reprezintă constantele ratei cinetice ale fosforilare, defosforilarea și degradare, respectiv. pentru și pentru. (D) Ieșirea modelului este prezentat un sistem aleatoriu cu următorii parametri: , , , , pentru și pentru , , .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g001

În timpul proteolizei, o dată ce o proteină substrat este fosforilată în mod corespunzător, ea este apoi ubiquitinată de către o ligatura ubicitinică SCF activă constitutivă [6] și apoi degradată de proteazom. În această lucrare, pentru simplitate am modelat degradarea ca o singură reacție de eliminare. Așa cum am menționat anterior, proteina Sic1 suferă ubicitinare și proteoliză dacă este fosforilată pe cel puțin șase situsuri [9] . În modelul nostru, am introdus un al doilea parametru, și generalizată că o dată sau de mai multe site - uri sunt fosforilate, proteina substrat este recunoscut de complexul SCF și trece prin degradare, așa cum este ilustrat în Figura 1A & B .

Interesul nostru este de a investiga schimbarea temporală a proteinei substratului, deoarece nivelul kinazei crește conversia substratului în forme degradabile și determinând eliminarea acestuia din sistem. A fost utilizată o abordare bazată pe ecuația diferențială (ODE) pentru a examina acest proces dinamic. Conform formalismului Michaelis-Menten pentru reacții enzimatice, substratul reacționează cu kinaza pentru a forma un complex substrat-kinază care poate, la rândul său, să disocieze pentru a forma fie enzima și substratul, fie enzima și un produs care are încă un fosforilat site. În mod similar, proteina fosforilată și fosfataza reacționează pentru a forma complexul substrat-fosfatază, care disociază pentru a forma fie proteina fosfatază și fosforilarea, fie fosfataza și un produs care are un fosforilat un situs mai mic.ODE pentru toate speciile legate de substrat în sistemul aleator descris mai sus. Este posibil, din fericire, să se facă simplificări substanțiale atunci când i) concentrațiile ambelor enzime sunt mult mai mici decât concentrația inițială a proteinei substratului sau ii) constantele asocierii enzime-substrat și viteza de disociere sunt mult mai mari decât constantele vitezei de cataliză (a se vedea detaliile din nota S1 ). Prima condiție este valabilă pentru experimentele in vitro . Pentru in vivo, nu știm în ce măsură aceste două condiții ar acoperi toate circumstanțele, din cauza informațiilor cinetice limitate privind reacțiile de fosforilare / defosforilare în mai multe etape. Cu toate acestea, având în vedere ceea ce se crede în general cu privire la etapa de limitare a vitezei în reacțiile enzimatice, considerăm că oricare dintre aceste condiții poate fi satisfăcută pentru o gamă largă de sisteme. Prin urmare, modelul prezentat aici reprezintă potențial un proces de degradare declanșat de fosforilare care captează caracteristicile comune ale multor proteine ​​multisite. În cele două condiții menționate mai sus, complexele enzimă-substrat evoluează într-o scară mult mai rapidă decât în ​​cazul substraturilor libere și se poate presupune că funcționează la stări cvasistiniare. Prin urmare,

Cu presupunerea că ATP este abundent, concentrația fiecărei stări substrat specifice cu o combinație unică de situri fosforilate și nefosforilate (denumită fosfo-stare în această lucrare) depinde de concentrația altor fosfo-stări care sunt în amonte sau în aval în fosforilare - rețeaua de fosforilare, concentrația kinazei și fosfatazei, precum și parametrii cinetici. Pentru ușurința de înțelegere, vom ilustra mai întâi ecuațiile pentru un sistem secvențial care implică stările fosfo-statice într-o linie dreaptă (a se vedea figura 1B pentru schema de reacție și figura 1C pentru notațiile parametrilor cinetici).(1a)(1b)(1c) în care,șireprezintă constantele ratei cinetice de fosforilare, defosforilare și, respectiv, degradare. ,șireprezintă concentrația de kinază, fosfatază și starea substratului cusitusuri fosforilate, respectiv. Trebuie remarcat faptul că cinetica de ordinul întâi este utilizată pentru a descrie reacția agregată de degradare; pentrușipentru. În această lucrare, presupunem în continuare căeste aceeași pentru toate fosfo-stările cusau mai multe locații fosforilate.

Pentru un sistem aleator, există variabile dependente care reprezintă concentrații ale tuturor posibilelor stări fosfo-stări. Fiecare dintre ele este determinată de reacțiile din amonte / în aval care o produc / o consumă, ceea ce poate fi descris matematic în mod similar cu cel din Eq. (1b) pentru sistemul secvențial:(2) undeeste orice stare fosfo-în rețeaua de fosforilare-de-fosforilare-degradare prezentată în Figura 1A ; șireprezintă toate fosfo-stările în amonte și în aval de, respectiv. De exemplu, pentrumulțimea de fosfo-stări din amonte cu un fosforilat un sit mai puținși setul de fosfo-stări în aval cu un alt sit fosforilat. denotă constantaviteză a reacțieifosforilareconversiea; în timp ceeste căpentru reacțiadefosforilareconversiea. reprezintă constanta vitezei de degradare pentru. În ciuda expunerii unei forme mai complicate, Eq. (2) este identic structural cu Eq. (1b) și descrie cinci tipuri de reacție care determină schimbarea fiecărei stări fosfatice: primii doi termeni pozitivi reprezintă creșteri datorate fosforilării fosfo-stărilor în amonte și a defosforilării fosfo-stărilor în aval; următorii doi termeni negativi reprezintă scăderi datorate fosforilării fosfo-stărilor în aval și defosforilării la fosfo-stările din amonte; ultimul termen negativ descrie degradarea.

Pentru a simula proteoliza declanșată de fosforilare, presupunem că o activitate bazală a fosfatazei este întotdeauna prezentă în sistem și substratul există inițial în starea nefosforilată. Kinaza este apoi introdusă în sistem și crește treptat (discuțiile detaliate vor fi urmate în secțiunea următoare), transformând substratul în mai multe și mai multe stări fosforilate. Pe măsură ce substratul devine suficient de fosforilat (adică cel puțin pe situri), acesta este eliminat prin reacția de degradare, ceea ce determină scăderea continuă a cantității totale a substratului pe măsură ce are loc proteoliza. Figura 1Dilustrează un rezultat tipic de simulare, în care sunt prezentate cantitățile totale, degradabile și nedegradabile ale substratului. Inspirat de o ipoteză anterioară că fosforilarea multisitelor permite pragurile temporale [26] , vom presupune că temporizarea exactă a concentrațiilor scade este crucială pentru anumite proteine, cum ar fi cele care reglează tranzițiile ciclului celular. În consecință, interesul nostru principal în această lucrare se concentrează pe forma curbei de răspuns reprezentând modificări ale concentrației substratului. Prin aplicarea tehnicilor standard de non-dimensionare (vezi nota S2 ), putem reduce toți parametrii la două seturi, în special și undeeste constanta vitezei pentru stările degradabile. Ulterior, ne concentrăm pe examinarea concentrațiilor normalizate ale substratului față de timpul fără dimensiuni (adică într-o anumită scală de timp selectată).

Prin "timp precis de scădere a concentrației" se înțeleg două caracteristici: i) începând cu momentul în care crește concentrația kinazei, nu există o schimbare apreciabilă a concentrației substratului până la momentul critic (adică pragul temporal) și ii) concentrația substratului scade imediat după trecerea pragului temporal. Un astfel de proces de degradare asemănător comutării permite în mod esențial existența proteinei substrat la două nivele distincte separate în timp, care ar putea fi o componentă fundamentală în mecanismul deciziilor celulare discrete și adesea ireversibile. Din punct de vedere grafic, aceste curbe de răspuns prezintă forma caracteristică inversă sigmoidă, așa cum este ilustrat de curba roșie pentru substratul nedegradabil din Figura 1D. În ce măsură degradarea este asemănătoare cu comutatorul, se poate cuantifica prin abrupta curbei de răspuns. Împrumutând ideea de bază a coeficienților de răspuns folosiți la măsurarea ultrasensibilității în răspunsurile la starea de echilibru [31] , aici definim un coeficient de răspuns în domeniul timpului pentru a caracteriza abrupta curbei de răspuns pentru degradarea proteinelor declanșate de fosforilare:(3) în careșireprezintă timpii în care concentrația substratului scade la 90% și 10% din cantitatea inițială, deoarece nivelul kinazei începe să crească. Cu cât această valoare este mai apropiată de una, cu atât apare mai curând curba de răspuns invers sigmoidă și cu cât este mai mare întreruperea degradării. Putem extinde în continuare acest index pentru a examina proprietățile locale asociate curbei de răspuns. Mai precis, următorii doi coeficienți de răspuns parțiali pot fi utilizați pentru a indica cât de abrupți scăderea substratului este în timpul primului și celui de-al doilea jumătate din procesul de degradare, respectiv.(4) undeeste încorporatun moment de timp mediu, momentul în care substratul atinge exact jumătate din concentrația inițială. Este de remarcat faptul că coeficientul global de răspuns,, este produsul acestor doi coeficienți de răspuns parțial. Aceasta înseamnă că întregul proces este similar dacă și numai dacă curba de răspuns este extrem de neliniară atât în ​​fazele timpurii, cât și în fazele târzii.

Profilul stimulului influențează foarte mult curba de răspuns

Stimul în modelul nostru este creșterea nivelului kinazei, dar foarte puțin se cunoaște exact cum se dezvoltă o kinază în degradarea proteinelor declanșată de fosforilare. Am început să considerăm trei tipuri de stimuli care diferă în ceea ce privește modificarea nivelului de kinază activă de la zero la aceeași valoare maximă în aceeași perioadă de timp: creșterea funcției pasului; creștere liniară; și creșterea neliniară. Figura 2 ilustrează aceste trei tipuri de stimuli kinazici și cum se elimină un substrat de nouă situri ca răspuns la fiecare dintre acestea. Este foarte clar că profilul kinazei afectează foarte mult când și cât de rapid dispare substratul. După cum se arată în figura 2B, atunci când kinaza crește brusc ca o funcție pas, nivelul substratului scade imediat într-o manieră exponențială, care ar putea fi foarte rapidă. Acest tip de stimuli este un caz ideal și este probabil să fie valabil numai pentru experimentele in vitro atunci când kinaza este adăugată instantaneu unui sistem de degradare dependent de fosforilare. În condiții in vivo , creșterea kinazei poate avea loc numai treptat, fie în mod liniar sau neliniar. Pentru stimulii neliniari, folosim o funcție sigmoidă cu formula generală a cărei claritate poate fi reglată prin parametru . După cum se exemplifică în figura 2C & D, acum substratul dispare la rate mai mici, comparativ cu cel ca răspuns la o creștere a funcției de kinază în funcție de pas și putem observa întârzieri temporare în scăderea substratului. Atât cantitățile totale, cât și cele nedegradabile ale substratului urmează o curbă inversă sigmoidă, prin urmare putem cuantifica în ce măsură răspunsul este comutator (adică combinarea pragului temporal și scăderea rapidă după prag) folosind coeficienții de răspuns introduși mai sus. Nu este surprinzător, cu cât profilul de kinază este mai clar, cu atât este mai rapid și mai asemănător cu cel de degradare. De exemplu, o creștere mai accentuată (nelinară) a kinazei din Figura 2D conduce la curbe de răspuns mai abrupte ale substratului total și nedegradabil, comparativ cu creșterea kinazei liniare din Figura 2C. Prin urmare, răspunsul exact al unei proteine ​​multisite într-un astfel de proces de degradare declanșat de fosforilare este determinat atât de proprietățile moleculare ale substratului, cât și de stimulul kinazei. Principalul nostru obiectiv, în această lucrare, este de a examina dacă și cum diferite proprietăți ale unei proteine ​​multisite îi pot permite să se comporte ca un comutator molecular, transformând intrările clasificate în ieșiri discrete. În consecință, pentru o investigație ulterioară, am ales să continuăm cu funcția sigmoidă pentru specificarea stimulului kinazei, care prezintă forme flexibile și poate capta bine multe profiluri temporale în sistemele reale. În plus, se poate demonstra că, pe măsură ce curbele de stimulare mai clare și mai clare sunt specificate (prin creșterea parametrului ), îmbunătățirea coeficientului de răspuns devine din ce în ce mai puțin semnificativă (a se vedea nota S3). În consecință, folosim stimularea sigmoidală ca standard în majoritatea activităților noastre. În acest context, numim o curbă de răspuns reprezentând profilul temporal al substratului "switch-like" dacă abrupta sa este mai mare decât cea a curbei de stimulare a kinazei, care poate fi determinată cantitativ prin compararea coeficientului de răspuns și contrapartida sa pentru curba de stimulare.

miniatură
Figura 2. Răspunsurile unei proteine ​​de nouă situsuri la trei tipuri de stimuli kinază.

(A) Concentrația kinazei active crește de la zero la o valoare maximă în trei moduri diferite: o funcție pas (Stimul 1 ); o funcție liniară (Stimulus 2, ); și o funcție neliniare (Stimul 3, de exemplu ). (B-D) Răspunsurile unui sistem aleatoriu la cele trei stimuli cu următorii parametri: , , , , și , .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g002

O altă proprietate relevantă a stimulului este durata acestuia. Este foarte probabil ca concentrația kinazei să nu fie menținută definitiv după ce atinge valoarea maximă. În schimb, va scădea treptat într-o perioadă de timp din cauza degradării sau din alte motive. Acesta este cazul pentru multe kinaze dependente de ciclină, care cresc și cad periodic în timpul ciclului celular. De exemplu, în sistemul Sic1, concentrația de Cln2, care activează Cdc28 kinaza pentru fosforilarea Sicl, crește treptat în faza G1, atinge valoarea sa maximă înainte de începutul fazei S și apoi scade [20] , [ 51] . Am investigat efectul duratei stimulului, iar simularea noastră a relevat un compromis între durata stimulului și forța. Figura 3compară curbele de răspuns rezultate dintr-un stimul slab și unul puternic cu trei durate. După cum se arată în figura 3A-C , când rezistența stimulului, determinată de nivelul maxim al kinazei, este scăzută, substratul scade încet și o cantitate substanțială rămâne în continuare când nivelul kinazei atinge valoarea maximă. În acest caz, durata kinazei este importantă și afectează în ce măsură substratul poate fi eliminat. De exemplu, durata kinazei din Figura 3A nu este suficientă pentru a îndepărta 90% din substrat. La rândul său, dacă este necesar (de exemplu pentru obținerea unei reglementări celulare asociate) pentru a reduce substratul la cel mult 10% din nivelul său inițial, kinaza ar trebui să fie menținută pentru o perioadă mai lungă de timp, cum ar fi cea din Figura 3B. Cu toate acestea, când rezistența stimulului este peste un anumit nivel critic, substratul a fost în mare măsură eliminat până când kinaza atinge valoarea maximă și, prin urmare, dacă cineza este menținută după aceea, nu contează, așa cum se arată în Figura 3D-F. Acest compromis aparent între puterea kinazei și durata este parte a provocării în alocarea resurselor pe care o celulă se confruntă în mod constant. Am presupus că pentru anumite procese de degradare a proteinelor asociate cu reglementările critice, cum ar fi cele în progresia ciclului celular, este mai de dorit ca celula să genereze un stimulent puternic, în timp ce scurt, pentru a realiza o degradare rapidă și robustă. În consecință, pentru restul acestei lucrări, vom lua în considerare puterea stimulului peste nivelul critic, suficient pentru a elimina majoritatea substratului în timpul creșterii kinazei.

miniatură
Figura 3. Efectul rezistenței și duratei stimulului.

(A-C) Un stimul slab, cu trei durate. (D-F) Un stimul puternic cu aceleași trei durate. Cea mai scurtă durată este 12 în (A) și (D): pentru , pentru , și pentru . Durata intermediară este de 16 (B) & (E). Parametri: sistem aleatoriu, , , , , , . Cu acest set de parametri, valoarea minimă a acestora duce la îndepărtarea a cel puțin 99% din substrat în timpul fazei de creștere a kinazei este de 1,7.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g003

Efectele , și ordinea de fosforilare / defosforilare

Cu un stimulent bine definit al kinazei, ne îndreptăm acum spre puzzle-ul principal al unei proteze multisite care se transformă în degradare, cel mai important, de ce site-urile multiple pot ajuta la realizarea acestei proprietăți. În plus, vrem să abordăm problema modului în care măsura în care dinamica degradării este transformată este determinată cantitativ.

Așa cum s-a descris mai sus, se presupune că o proteină cu situsuri de fosforilare este degradabilă atunci când este fosforilată pe cel puțin locurile. Ca studiu de caz, au fost examinate diferite valoripentru a modela degradarea Sic1. O întrebare care se poate ridica aici este ce fel de SIC1 contează pentru celulă, fracțiunea nedegradabilă sau proteina totală (inclusiv fracțiile degradabile și nedegradabile). Răspunsul depinde de biochimia modului în care Sic1 inhibă ciclinii necesari pentru replicarea ADN-ului și modul în care acesta devine ubiquitinat. Dacă Sic1 eliberează Clb5 / 6 de îndată ce este ubiquitinat de către complexul SCF, atunci numai fracțiunea nedegradabilă este importantă ca inhibitor CDK. Altfel, dacă Clb5 / 6 este eliberat din Sic1 numai atunci când Sic1 este distrus de proteosom, trebuie luată în considerare cantitatea totală de Sic1. Din păcate, nu se știe care dintre cazurile de mai sus este adevărat. Prin urmare, = 1, 5 și 9.

Așa cum este arătat în figura 4 , profilul temporal al proteinei totale nu se modifică prea mult atunci când este variat. Cu toate acestea, în ceea ce privește fracțiunea non-degarabilă, profilurile sale temporale diferă semnificativ pentru diferite valori. În mod specific, coeficientul de răspuns pentru , și este de 3,8, 2,3 și respectiv 10. Evident, conduce la cel mai mic coeficient de răspuns și deci la cea mai mare dinamică a degradării. În acest scenariu, profilul fracțiunii non-degarabile prezintă atât un prag temporal observabil, cât și o scădere rapidă după trecerea pragului. În contrast, profilul pentru care nu prezintă prag temporal; în timp ce pentru, chiar dacă profilul prezintă, de asemenea, un prag temporal, suferă o coadă lungă în perioada ulterioară a răspunsului. Răspunsul foarte neliniar al sistemului, când poate fi atribuit celor două sub-lanțuri distincte ale fosfo-stărilor create în acest caz. Sub-lanțul nedegradabil poate tampona semnalul kinazei în faza timpurie, creând astfel pragul temporal. În timpul fazei ulterioare a răspunsului după trecerea pragului temporal, sub-lanțul degradabil trage eficient proteina substratului, chiar înainte ca substratul să sufere o distrugere finală și, ulterior, reduce foarte rapid piscina nedegradabilă.

miniatură
Figura 4. Răspunsurile temporale ale unui sistem aleatoriu de nouă situri la diferite valori ale lui m .

Cel mai mare răspuns la schimbare are loc când . (A) , . (B) , . (C) , . Parametrii de sistem: , , pentru și pentru , , .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g004

Putem cuantifica neliniaritatea stimulului kinazei cu un coeficient de stimulare similar cu coeficientul de răspuns: raportul dintre momentul în care kinaza atinge 90% din valoarea maximă și timpul în care acesta atinge 10%. Stimulul pe care l-am folosit corespunde unui factor de 9 și, în cazul acestui stimulent treptat, o scădere a formei nedegradabile a proteinei cu o valoare de 2,3. Într-un alt cuvânt, o singură macromolecule poate crește nonlinearitatea sistemului de patru ori. Aceste rezultate demonstrează capacitatea potențială a proteinelor multisite în crearea comutatoarelor biologice.

Rezultatele de mai sus pot explica de ce în fosforilarea S. cerevisiae sunt necesare cel puțin șase din cele nouă situri pentru degradarea Sic1. Conform modelului nostru, acest design ar permite proteinei Sic1 să răspundă semnalului kinazei într-un mod foarte comutat: fracția nedegradabilă a acestui inhibitor CDK nu se schimbă în mod semnificativ înainte de un prag temporal, chiar dacă kinaza a crescut, apoi odată ce pragul temporal este trecut, fracțiunea nedegradabilă scade foarte rapid. Se presupune că această degradare asemănătoare comutării este crucială pentru funcția de reglare Sic1 în timpul tranziției G1 / S a ciclului celular. Altfel, dacă Sic1 s-ar putea lega de Cdc4 pentru ubiquitinizare și degradare ulterioară, fie imediat după ce a fost fosforilat pe un singur sit (adică) sau numai atunci când a fost complet fosforilat (ie ), eliminarea Sic1 nu ar fi fost foarte asemănătoare cu cea a comutării, iar tranziția G1 / S nu ar fi putut avea loc într-o manieră da / nu. Această ipoteză va necesita viitoare validări experimentale și pot fi concepute teste specifice pentru a testa diferitele componente ale acestei teorii. De exemplu, este interesant să se examineze experimental dacă Sic1 într-un complex cu Cdc4 (adică forma degradabilă a Sic1) poate încă să inhibe Clb5 / 6.

În restul acestui studiu, ne vom baza pe ipoteza de mai sus, adică ne vom concentra asupra modului în care fracțiunea nedegradabilă a proteinei substratului scade ca urmare a creșterii kinazei. Aici, examinăm mai întâi efectele numărului total de situri , și numărul de prag pentru degradare ,. Rezultatele noastre de simulare sunt rezumate în Figura 5A pentru fosforilarea / defosforilarea aleatoare și în figura 5B pentru procesul secvențial. Mai multe concluzii pot fi trase pe baza acestor rezultate. În primul rând, atât pentru procesele aleatorii, cât și pentru cele secvențiale, în general, locurile pe care le are o proteină, cu atât mai mult se poate întâmpla în dinamica degradării acesteia. Coeficientul de răspuns pentrueste de aproximativ 7,5, ceea ce nu este mult mai mic decât coeficientul de stimulare de 9. Prin urmare, o proteină cu un singur sit nu generează o ieșire semnificativ mai mare decât cea de intrare. Pe măsură ce numărul total de situri, crește, coeficientul de răspuns realizabil scade, adică proteina se poate degrada într-o manieră tot mai mare. În al doilea rând, numărul de puncte de prag pentru degradare, joacă un rol important în determinarea exactă a măsurii în care răspunsul este similar. Pentru procesele aleatoare, cel mai mic coeficient de răspuns ( de exemplu , răspunsul cel mai comutator asemănător) este atins atunci când este aproape de multe ori și puțin mai mică decât jumătate din ( de exemplu , pentru , pentru , și pentru). In contrast, pentru procesele secvențiale, o valoare doar puțin mai mică decât oferă cea mai comutator similar răspuns ( de exemplu , pentru , pentru , și pentru ). În cele din urmă, răspunsul unui sistem secvențial este, în general, mai asemănător unui switch decât cel al unui sistem aleatoriu pentru valori date și .

miniatură
Figura 5. Efectele numărului de situri de fosforilare ( n ) și pragul de degradare ( m ).

Coeficientul de răspuns al fracțiunii nedegradabile pentru diferite valori de n și m ( m variază de la 1 la n ) sunt prezentate pentru procesele aleatorii (A) și secvențiale (B). Parametrii de sistem: , , pentru și pentru , , .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g005

Efectele parametrilor cinetici

Apoi, vom examina un alt factor important care afectează dinamica degradării - parametrii cinetici. În modelul prezentat mai sus, există trei grupuri de parametri cinetici, asociați cu fosforilarea, defosforilarea și, respectiv, reacțiile de degradare. Ne-am concentrat pe două efecte specifice și am analizat sensibilitatea.

Schimbarea cineticii de fosforilare și de fosforilare de-a lungul lanțului.

Reacțiile de fosforilare au fost studiate pe larg, cu toate acestea, datele cinetice ale fosforilării în mai multe etape rămân limitate. O excepție este factorul de transcripție Pho4 în calea de semnalizare care răspunde la fosfat în drojdia de înmugurire. Pho4 conține cinci situsuri fosforilabile pentru kinaza Pho80-Pho85. Parametrii kinetici ai fosforilării Pho4 de către Pho80-Pho85 au fost măsurați prin integrarea datelor experimentale și modelarea computațională de către Jeffery și colegii [52]. Sa constatat că constantele vitezei de fosforilare pentru toate cele cinci etape de fosforilare sunt de aceeași ordine de mărime. Pe baza acestor date, am presupus în analiza de mai sus că constantele ratei tuturor reacțiilor de fosforilare sunt aceleași. În ceea ce privește defosforilarea, în prezent sunt disponibile mai puține date despre cinetica în mai multe etape.

Având în vedere că sunt disponibile date foarte limitate pentru cinetica în mai multe etape a fosforilării / depoforilării, vom explora scenariul posibil că etapele anterioare de fosforilare / defosforilare pot suprima sau spori fosforilarea / defosforilarea ulterioară a siturilor rămase, în special dacă fosfo-starea exactă afectează configurația substratului (de exemplu, permiterea sau dezactivarea legării unei proteine ​​din aval în calea degradării) și astfel parametrii cinetici se pot schimba de-a lungul lanțului de fosforilare / defosforilare. Aici, considerăm cazul în care constantele vitezei de fosforilare / defosforilare pot crește sau scădea după trecerea pragului de degradare. Comparația celor cinci cazuri arată în figura 6, dinamica degradării substratului, adică profilul temporal al fracțiunii nedegradabile a proteinei, nu se modifică prea mult dacă rata netă de fosforilare (fosforilarea împotriva defosforilării) este mai rapidă decât cea a reacției de degradare (vezi figura 6A, B, E ). Pe de altă parte, dacă etapele de fosforilare pentru partea degradabilă sunt prea lente în comparație cu reacția de degradare, datorită fie fosforilării mai lente ( Figura 6C ), fie defosforilării mai rapide ( Figura 6D ), eliminarea fracțiunii nedegradabile a proteinei devine mai puțin de tip switch, după cum indică scăderea mai puțin rapidă după întârzierea inițială.

miniatură
Figura 6. Efectele modificărilor constantelor ratei de fosforilare și de defosforilare de-a lungul lanțului.

(A) Nici o diferență între fracțiune degradabil și nedegradabile în ceea ce privește ratele cinetice ale reacțiilor de fosforilare și defosforilare: și pentru . (B) Kinaza fosforilează fracția degradabilă mai rapid decât fracția nedegradabilă: pentru și pentru . (C) Kinaza fosforilează fracția degradabilă mai lent decât fracția nedegradabilă: pentru și pentru . (D) Fosfataza defosforila fractia degradabila mai rapid decat fractia nedegradabila: pentru si pentru . (E) Fosfataza defosforila fractia degradabila mai lent decat fractia nedegradabila: pentru sipentru . Ieșirile sunt prezentate pentru un sistem secvențial cu următorii parametri: , , pentru și pentru , , .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g006

Rata de fosforilare / defosfilare față de degradare.

După cum sa descris mai sus, modelul nostru consolidează ubicitinarea și distrugerea prin proteazom într-o singură reacție de degradare. Relativ puțină este cunoscută despre cinetica ubicuitării în general. Din fericire, un studiu recent a dezvăluit cinetica polubiquilării Sic1 [53] , care este mai lentă decât cinetica de fosforilare în mai multe etape a Pho4. În lumina acestor dovezi, am presupus că degradarea este mai lentă decât fosforilarea / defosforilarea pentru majoritatea analizelor prezentate mai sus. Cu toate acestea, având în vedere datele limitate disponibile în prezent și diversitatea care ar putea exista în evenimentele moleculare asociate, vom explora modul în care ratele relative ale fosforilării / defosforilării vs. degradare afectează dinamica degradării. Mai exact, comparăm coeficientul de răspunsdin două cazuri: într-una, degradarea este mai lentă decât fosforilarea / defosforilarea ( figurile 7A și C , care sunt figuri alternative din figura 5 ); în cealaltă, degradarea este comparabilă cu fosforilarea / defosforilarea ( Figura 7B & D ). Se constată că pentru procedeele secvențiale, în cazul în care degradarea este la fel de rapidă ca fosforilarea / defosforilarea, eliminarea substratului nedegradabil devine mai asemănătoare, așa cum este indicat de cel mai mic din Figura 7B în comparație cu cel din Figura 7A . Cu toate acestea, cel mai mic este acum atins atunci când , adică avantajul de a avea un număr mare de situri ( ) și un prag intermediar () în crearea unui răspuns asemănător cu comutatorul dispare. Pentru procese aleatorii, degradarea mai rapidă duce, de asemenea, la reducere, în timp ce răspunsul cel mai asemănător cu comutarea apare atunci când este aproape de jumătate (a se vedea figura 7C & D ). Rămâne de văzut dacă natura folosește toate aceste regimuri diferite în proiectarea comutatoarelor de degradare a proteinelor.

miniatură
Figura 7. Rata de fosforilare / defosfilare față de degradare.

Sistemele cu constante de viteză de degradare lentă și rapidă sunt comparate în termeni de claritate a profilului temporal al fracțiunii nedegradabile pentru procesele secvențiale (A-B) și aleatorii (C-D). Coeficienții de răspuns sunt prezentate pentru următorii parametri: , , , .

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g007

Analiza de sensibilitate.

Modelul nostru de fosforilare multisite a declanșat degradarea proteinelor este supus unor multe surse de incertitudine, incluzând lipsa / inexactitatea datelor și fluctuațiile biologice. Pentru a investiga modul în care variațiile parametrilor cinetici afectează ieșirea modelului (adică coeficientul de răspuns al substratului nedegradabil) am efectuat analiza sensibilității. Ca o demonstrație, aici ne concentrăm asupra unui sistem secvențial cu și . Există un total de nouă constante de viteză pentru fosforilare, nouă constante de viteză pentru defosforilare și cinci constante de viteză non-zero pentru degradare.

Mai întâi, examinăm modul în care perturbarea fiecărui parametru afectează ieșirea modelului. Am ales să modificăm parametrul în limita a 20% din valoarea sa nominală, care corespunde scenariului de bază discutat mai sus ( și pentru , pentru ). Sa constatat că astfel de perturbații au ca rezultat schimbări foarte nesemnificative ale coeficientului de răspuns pentru substraturile nedegradabile (mai puțin de 2%). Această analiză arată, de asemenea, că fiecare parametru afectează coeficientul de răspuns într-o manieră monotonă (vezi exemplele din Figura S1 ). În mod specific, creșterea unei constante a ratei de fosforilare scade coeficientul de răspuns; creșterea unei constante de defosforilare crește; în timp ce modificarea unei constante a ratei de degradare nu are un efect apreciabil.

Apoi, perturbăm toți parametrii simultan în mod independent și examinăm efectul asupra ieșirii modelului. Alegem aleator valorile parametrilor bazate pe o distribuție normală în care media corespunde scenariului de bază discutat mai sus și deviația standard este setată la 20% din media. Această prelevare a fost efectuată de 1000 de ori. Media producției modelului (adică coeficientul de răspuns al substratului nedegradabil) este 1,81, iar deviația standard este de 0,04, aproximativ 2,2% din media. De asemenea, am fost interesați de modul în care fiecare parametru se corelează cu ieșirea modelului în acest context și a calculat coeficientul de corelare parțială (PRCC).[54] . Așa cum se arată în figura 8A , constantele vitezei de degradare arată o corelație neglijabilă cu claritatea profilului temporal al substratului nedegradabil; în timp ce parametrii de fosforilare și defosforilare arată corelații semnificative. Creșterea constantelor vitezei de fosforilare schimbă sistemul spre fracțiunea degradabilă, ceea ce duce la o epuizare mai rapidă a substratului nedegradabil și, prin urmare, la un coeficient de răspuns mai mic. Scăderea parametrilor kinetici ai defosforilării are același efect, ceea ce explică coeficientul de corelație pozitiv. Figura 8B-D ilustrează parcelele de împrăștiere pentru trei parametri , și , care prezintă cel mai mare coeficient de corelație în fiecare set de parametri.

miniatură
Figura 8. Analiza sensibilității pentru constantele vitezei de fosforilare, defosforilare și degradare.

Coeficienții corelaționali ai rangului parțial calculat pentru toate cele nouă constante ale vitezei de fosforilare, nouă constante ale vitezei de defosforilare și cinci constante de viteză de degradare non-zero (A). Parcelele scatter ale coeficientului de răspuns al substratului nedegradabil pentru (B), (C) și (D). Rezultatele sunt bazate pe 1000 de simulări pentru un sistem secvențial cu , , . Parametrii sunt selectați aleatoriu din spațiul distribuit în mod normal, unde mijloacele corespund scenariului de bază ( și pentru , pentru ), iar abaterea standard este setată la 20% din media.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g008

Analiza de mai sus presupune perturbarea simultană și independentă a tuturor parametrilor care explică anumite tipuri de incertitudini, cum ar fi fluctuațiile stochastice ale cineticii. S-ar putea să existe, de asemenea, incertitudine asociată cu enzimele care afectează un întreg set de parametri. Astfel, într-o altă analiză, am considerat un total de trei parametri în modelul nostru (unul pentru toate reacțiile de fosforilare, unul pentru toate reacțiile de defosforilare și unul pentru toate reacțiile de degradare) și apoi le-a perturbat într-o manieră similară. Rezultatele a 1000 de probe și simulări au condus la un coeficient de răspuns mediu de 1,81 și o deviație standard de 0,09 (adică 5% din media).

Aceste rezultate arată în mod clar faptul că comportamentul comutator al unei degradări a proteinei multisite este foarte robust împotriva fluctuațiilor aleatorii ale parametrilor cinetici.

Efectul preferinței site-ului

În cele din urmă, vom lua în considerare efectul preferinței site-ului asupra dinamicii degradării. În sistemul complet aleatoriu descris mai sus, niciun situs nu este preferat față de alte situsuri în ceea ce privește afinitatea pentru kinază. Cu toate acestea, pentru proteinele reale, datorită efectului aminoacizilor din vecinătate, de obicei unele site-uri sunt mai predispuse să se asocieze cu kinaza și să devină fosforilate. În consecință, unele căi din rețeaua de fosforilare / defosforilare sunt mai dominante decât altele. Un exemplu bine studiat este proteina kinaza ERK a semnalului extracelular reglată în cascada MAPK. ERK conține două situsuri fosforilabile, Thr188 și Tyr190, pentru MEK kinaza. Parametrii cinetici estimați indică faptul că fosforilarea Tyr este mult mai rapidă decât fosforilarea lui Thr [55], cu constantele ratei corespunzătoare care diferă de o ordine de mărime. În sistemul Sic1, Thr45 este preferat pentru fosforilare cu Cln2-Cdc28 peste alte site-uri [9] . În sistemul Pho4, SP6 este preferat în comparație cu alte site-uri [52] . Această proprietate a preferinței sitului poate fi ușor încorporată în modelul nostru prin atribuirea unei valori mai mari a constantei vitezei de fosforilare pentru fosforilarea situsului preferat.

Când există preferința site-ului, așa cum era de așteptat, modelul nostru prezice că ștergerea unui situs preferat are un efect mai puternic atât în ​​creșterea timpului de înjumătățire a proteinei, cât și în reducerea clarității curbei de răspuns, comparativ cu ștergerea siturilor obișnuite (a se vedea Figura 9). Cu toate acestea, acest efect devine mai puțin semnificativ, pe măsură ce numărul locurilor de fosforilare crește. Într-un alt cuvânt, rolul unui anumit sit, chiar și unul preferat, în răspunsul sistemului la kinază devine mai puțin semnificativ atunci când crește numărul de site-uri totale. Acest rezultat sugerează că un alt avantaj al unui număr mai mare de site-uri ar putea fi consolidarea robusteții. Dacă proteina substratului conține multe site-uri, îndepărtarea unuia dintre site-uri (de exemplu, datorită mutațiilor adverse) este mai puțin probabilă ca funcția sa să se descompună, adică sistemul poate tolera perturbări mai bune.

miniatură
Figura 9. Efectul preferinței site-ului.

Un site este preferat în comparație cu alte site-uri pentru kinază. Ștergerea acestui sit este comparată cu ștergerea unui situs obișnuit pentru proteinele cu trei situri (A) și nouă (B) în ceea ce privește claritatea profilului temporal al fracțiunii nedegradabile. Rezultatele sunt prezentate pentru un sistem aleatoriu cu următorii parametri: , pentru A și , pentru B, , , . Constanta ratei de fosforilare pentru situl preferat este de 100 de ori mai mare decât cea pentru celelalte site-uri.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.g009

Discuţie

În această lucrare am analizat sistematic un model general pentru procesele de degradare a proteinelor declanșate de fosforilarea multisitelor. Modelul a fost dezvoltat în mare măsură pe baza a ceea ce s-a descoperit experimental pentru Sic1, o proteină nouă situs în S. cerevisiae , în timpul degradării sale la tranziția G1 / S a ciclului celular. Cel mai important, proteina devine degradabilă după fosforilare pe un număr critic de situri [9] . Inspirat de presupunerile teoretice ulterioare privind rolul fosforilării multisite în reglarea dinamicii celulare [26], ne-am propus să abordăm întrebarea dacă și cum fosforilarea multisitei poate determina o proteină să răspundă la un semnal kinazic care se schimbă treptat și să se degradeze într-o manieră foarte asemănătoare cu switch-ul. Aici, ne concentrăm asupra răspunsurilor tranzitorii de tip switch-uri, ale căror caracteristici includ atât pragul temporal, cât și eliminarea rapidă dincolo de punctul de prag. Profilul temporal al proteinei într-un astfel de proces prezintă o formă sigmoidală inversă și interesul nostru principal este abrupta curbei pe care o cuantim cu coeficientul de răspuns, definit ca raportul dintre timpul necesar pentru scăderea la 10% din concentrația inițială a proteinei față de cel luat până la 90%. Studiul nostru amplu de simulare a arătat că fosforilarea multisitelor este într-adevăr capabilă să genereze un comutator de degradare. În plus, am examinat în mod sistematic modul în care măsura în care degradarea este transformată este determinată de diferitele caracteristici ale sistemului, incluzând numărul total de situri, numărul de puncte de degradare pentru degradare, ordinea fosforilării / defosforilării, parametrii cinetici , și preferința locului în fosforilare.

Având în vedere parametrii cele mai necunoscute implicate în modelul nostru, rămâne să fie testat dacă predicțiile exacte sunt de acord cu degradarea efectivă a proteinelor multisite, cum ar fi Sic1. Pe de altă parte, fosforilarea multisită a apărut ca o temă recurentă deoarece cercetătorii disecă calea de degradare dependentă de proteazom diferite proteine ​​din diferite specii. tabelul 1ilustrează unele dintre aceste exemple pe care am reușit să le compilam ușor prin efectuarea unei căutări de literatură privind fosforilarea multisitelor și degradarea proteinelor. Este de remarcat faptul că multe dintre aceste proteine ​​cu situri multiple de fosforilare implicate în degradare joacă roluri importante în reglarea ciclului celular, ceea ce nu este surprinzător atunci când se ia în considerare importanța extremă a timpului exact al unei cascade de evenimente necesare pentru ciclul celular corect progresie. De exemplu, reglementarea Rum1, omologul funcțional al Sic1 în Schizosaccharomyces pombe , ar putea implica, de asemenea, până la opt site-uri de fosforilare [56]. Ca un exemplu în organismele superioare, RUNX1, un factor de transcripție asociat cu leucemia mieloblastică acută cu maturizare (M2 AML), se degradează la tranziția G2 / M-G1 și a fost sugerată extinderea fosforilării la cele unsprezece situri [57 ] . În plus față de controlul ciclului celular, degradarea precisă a proteinelor ar putea fi, de asemenea, critică pentru multe alte procese de reglementare, cum ar fi eliminarea discursului încrucișat al creșterii și creșterii filamentoase în Saccharomyces cerevisiae [58] și semnalizarea luminoasă în Arabidopsis thaliana [59]. În lumina acestei răspândiri a implicării fosforilării multisite în reglarea degradării proteinei, pare plauzibil că mecanismul molecular descris de modelul nostru ar putea reprezenta un principiu comun de proiectare utilizat de natură pentru construirea comutatoarelor de degradare a proteinei. Anumite detalii ale modelului nostru pot necesita modificări sau extensii, de exemplu capacitatea proteinei substratului de a se lega de ubiquitin ligaza și de a suferi o degradare dependentă de proteazom poate crește treptat, în loc să fie în mod pas cu pas. Cu toate acestea, concluzia generală că fosforilarea multilitară oferă o platformă foarte eficientă și flexibilă pentru degradarea proteinelor de tip switch-switch este probabil să se aplice unei game largi de proteine ​​din diferite specii eucariote.

Lucrarea prezentată aici pentru degradarea declanșată de fosforilare are, de asemenea, anumite limitări. Mai întâi, am folosit un model cinetic simplificat, așa cum sa explicat mai sus și în nota S1, iar ipotezele care stau la baza concentrațiilor enzimei / substratului sau ale parametrilor cinetici nu pot fi aplicabile tuturor sistemelor biologice. În al doilea rând, am considerat enzime libere în modelul nostru, în timp ce în experimente, este de obicei concentrația totală de enzime care poate fi măsurată. Rămâne să fie explorat, poate cu un model alternativ unde complexele enzimă-substrat sunt incluse în mod explicit, cum aceste două cantități se leagă unul de celălalt. În al treilea rând, am examinat două cazuri extreme de fosforilare complet secvențială și aleatorie. Sistemele biologice reale ar putea fi între ele. Procesele aleatorii pot fi favorizate în evoluția biologiei deoarece ar putea oferi mai multe forme intermediare ale proteinei fosforilate și vor permite o mai mare flexibilitate pentru reglarea proteinelor. In orice caz, fosforilarea nu poate avea loc în întregime aleatoriu și datorită efectelor de vecinătate unele site-uri au o afinitate mai mare pentru kinază sau fosfatază. În cele din urmă, am presupus că numai o singură kinază este responsabilă de fosforilare, în timp ce se știe că pentru anumite substraturi s-ar putea implica mai multe kinaze. Pentru proteina Sic1, diferite kinaze sunt implicate în diferite procese sau la momente diferite. Cdc28 și Pho85 aparent fosforilează Sic1 la mai multe situsuri la sfârșitul lui G1 în drojdia înfloritoare[60] , [61] . Cu toate acestea, Ck2 fosforilează Sic1 la Ser201 la scurt timp după sinteza Sic1 de novo [62] . Ime2 este o altă kinază care este necesară pentru distrugerea în timp util a Sic1 în timpul sporulării [63] . În plus, Hog1, o proteină kinază activată de stres fosforilează un singur reziduu care contribuie la oprirea la faza G1 ca răspuns la solicitări precum osmolaritatea înaltă [64] . Includerea mai multor kinaze într-un model extins ar putea conduce la o înțelegere mai aprofundată a comutatoarelor degradate ale proteinei reale, precum și la integrarea semnalelor.

Cel mai mare obstacol în studiile teoretice privind fosforilarea și defosforilarea proteinei este acela că parametrii biochimici nu sunt cunoscuți pentru majoritatea biosistemelor; chiar și pentru sistemele bine studiate, parametrii sunt obținuți prin experimente in vitro și în condiții specifice care nu reflectă realitățile biologice. O altă dificultate este lipsa de cunoștințe calitative privind procesul de fosforilare și dinamica degradării. Chiar și numărul exact al siturilor de fosforilare pentru o anumită proteină nu este furnizat de obicei în literatură. Dintre proteinele enumerate în Tabelul 1 , foarte puține au fost studiate cu atenție în legătură cu legătura cantitativă dintre fosforilarea multisite și dinamica degradării.

O provocare principală în înțelegerea cantitativă a proceselor de fosforilare și defosforilare este identificarea și cuantificarea speciilor de proteine ​​fosforilate. Spectrometria de masă este folosită pe scară largă ca metodă de măsurare rapidă, sensibilă și de mare viteză în identificarea și cuantificarea fosforilării proteice. De exemplu, Olsen și colegii au detectat și cuantificat fosforilarea a 6.600 de situsuri pe 2.244 proteine ​​ca răspuns la un stimul în celulele mamifere prin etichetarea izotopică stabilă de către aminoacizii în cultura celulară [65]. În majoritatea abordărilor MS, proteina substratului este digerată în peptide și gradul de fosforilare la un loc este calculat pe baza abundenței sumare a peptidelor care conțin acest situs. Pentru o proteină cum ar fi Sic1 care are nouă situsuri de fosforilare, o soluție proteică parțial fosforilată poate conține stări fosforylate diferite ale proteinei, în timp ce chiar în cazul ideal în care fiecare peptidă conține doar un singur sit al fosforilării, pur și simpluconcentrațiile pot fi măsurate din SM. Deși rezultatele concentrațiilor fosfopeptidelor pot fi utilizate pentru anumite caracterizări, cum ar fi determinarea preferinței site-ului, acestea nu sunt suficiente pentru estimarea parametrilor cinetici. Noi abordări sunt necesare pentru a aborda această problemă. De exemplu, s-ar putea lua în considerare utilizarea unui set de mutanți, fiecare cu un subset al siturilor de fosforilare, în analizele cinetice și apoi integrarea sistematică a datelor.

În rezumat, în această lucrare am investigat capacitatea unei singure proteine ​​cu multiple situsuri de fosforilare în conversia unei intrări gradate la un semnal de ieșire asemănător comutatorului în domeniul timpului. Am dori să subliniem că, în afară de fosforilarea, o modificare dominantă post-translațională pentru reglarea stabilității și activității proteinei, alte tipuri de modificări precum ubiquitinizarea, metilarea și glicozilarea s-au dovedit a fi implicate în reglarea stabilității, activității și translocării macromolecule. Modelul prezentat aici sau variațiile acestuia poate explica și prezice eventual comportamentul acestor sisteme de modificări multisite. În cele din urmă, așa cum s-a demonstrat printr-un comutator de semnalizare sintetic cu o singură moleculă, utilizând mai multe domenii autoinhibitoare multiple [66], principiul designului multisite dezvăluit de modelul nostru poate ajuta în ghidarea ingineriei comutatoarelor de degradare a proteinelor sintetice, care pot avea diverse aplicații biomedicale.

metode

Sistemele de ecuații diferențiale obișnuite au fost formulate și rezolvate cu MATLAB 7.1. Codurile sunt disponibile pe site-ul nostru http://www.engin.umich.edu/dept/che/research/lin/downloads.html .

Evenimentele integrate includ: legarea ATP și a fosfospeciilor de kinaza, disocierea fosfospeciilor din kinază, reacția chimică a fosforilării și disocierea produsului din kinază. Evenimentele integrate includ: legarea ADP și a fosfospeciilor de fosfatază, disocierea fosfospeciilor din fosfatază, reacția chimică a defosforilării și disocierea produsului din fosfatază. include toate evenimentele după fosforilare la proteoliză.

informatii justificative

Notă S3.

Efectul clarității profilului stimulului.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.s003

(0,05 MB PDF)

Figura S1.

Schimbarea coeficientului de răspuns pentru substratul nedegradabil la perturbarea cu un singur parametru.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0014029.s004

(20,24 MB TIF)

Recunoasteri

De asemenea, le mulțumim Dr. Sohrab Soltani pentru că a ajutat la programarea MATLAB pentru sistemul aleator.

Contribuțiile autorului

Concepute și proiectate experimentele: SMVK XNL. Efectuarea experimentelor: SMVK. Analiza datelor: SMVK XNL. Reactivi / materiale / instrumente de analiză contribuite: SDV SDM. Scrierea hârtiei: SMVK ACV XNL.

Referințe

  1. 1. Cohen P (2000) Reglarea funcției proteice prin fosforilare multisite - o actualizare de 25 de ani. TIBS 25: 596-600.
  2. 2. Patwardhan P, Miller WT (2007) Fosforilarea procesuală: Mecanism și importanță biologică. Cell Signal 19: 2218-2226.
  3. 3. Skowyra D, Craig KL, Tyers M, Elledge SJ, Harper JW (1997) Proteinele F-box sunt receptori care recrutează substraturi fosforilate în complexul ubiquitin-ligază SCF. Cell 91: 209-219.
  4. 4. Patton EE, Willems AR, Tyers M (1998) Controlul combinatorial în proteoliză dependentă de ubiquitin: nu ipoteza Skp ipoteza F-box. TIG 14 (6): 236-243.
  5. 5. Deshaies RJ (1997) Fosforizarea și proteoliza: parteneri în reglarea diviziunii celulare în drojdie înfloritoare. Curr Opin Genetics Dev 7: 7-16.
  6. 6. Ang XL, Harper JW (2005) Degradarea proteinelor mediate de SCF și controlul ciclului celular. Oncogene 24: 2860-2870.
  7. 7. Hunter T (2007) Vârsta de crosstalk: fosforilarea, ubiquitination, și dincolo. Mol Cell 28: 730-738.
  8. 8. Verma R, Annan RS, Huddleston MJ, Carr SA, Reynard G, și colab. (1997) Fosforilarea Sic1p de G1 Cdk necesară pentru degradarea și intrarea în faza S. Science 278: 455-460.
  9. 9. Nash P, Tang X, Orlicky S, Chen Q și colab. (2001) fosforilarea multisite a unui inhibitor CDK stabilește un prag pentru debutul replicării ADN. Natura 414 (29): 514-521.
  10. 10. Vlach J, Hennecke S, Amati B (1997) Degradarea dependentă de fosforilare a inhibitorului kinazei dependentă de ciclina p 27 Kip 1 . EMBO J 16 (17): 5334-5344.
  11. 11. Tsvetkov LM, Yeh KH, Lee SJ, Sun H, Zhang Hui (1999) p 27 Kip 1 ubiquitinarea și degradarea este reglementată de către SCF Skp 2 complex prin fosforilate Thr187 în p27. Curr Biol 9 (2): 661-664.
  12. 12. Chu I, Arnaout A, Kahn H, Hanna W, Narod S, și colab. (2007) p27 Fosforilarea prin Src reglează inhibarea ciclinei E-Cdk2. Cell 128: 281-294.
  13. 13. Roach PJ (1991) Multisite și fosforilarea proteinelor ierarhice. J Biol Chem 266 (22): 14139-14142.
  14. 14. Buchkovich K, Duffy LA, Harlow E (1989) Proteina retinoblastomului este fosforilată în timpul fazelor specifice ale ciclului celular. Cell 58: 1097-1105.
  15. 15. Knudsen ES, Wang JY (1996) Reglarea diferențială a funcției proteinei retinoblastomului de către situsurile specifice de fosforilare Cdk. J Biol Chem 271 (14): 8313-8320.
  16. 16. Ezhevsky SA, Ho A, Becker-Hapak M, Davis PK, Dowdy SF (2001) Reglarea diferențială a proteinei supresoare a tumorii retinoblastomului de către complexele kinazice dependente de ciclina G1 in vivo. Mol Cell Biol. 21 (14): 4773-4784.
  17. 17. Kim SY, Song EJ, Lee KJ, Ferrell JE Jr (2005) Multisite de fosforilare în fază M a Xenopus Wee1A. Mol Cell Biol 25: 10580-10590.
  18. 18. Nugroho TT, Mendenhall MD (1994) Un inhibitor al proteinei kinazei dependentă de ciclină de drojdie joacă un rol important în asigurarea integrității genomice a celulelor fiice. Mol Cell Bio 14: 3320-3228.
  19. 19. Lengronne A, Schwob E (2002) Inhibitorul CDK de drojdie Sic1 previne instabilitatea genomică prin promovarea licențierii de origine a replicării la G1 târziu. Mol Cell 9: 1067-1078.
  20. 20. (2007) Fosforilarea inhibitorului Sic1 a ciclinelor de tip B în Saccharomyces cerevisiae nu este esențială, dar contribuie la robustețea ciclului celular. Genetics 176: 1541-1555.
  21. 21. Schwob E, Bohm T, MD Mendenhall, Nasmyth K (1994) Inhibitorul de ciclin kinază de tip B, p 40 SIC 1, controlează tranziția G1 la S în S. cerevisiae . Cell 79: 233-244.
  22. 22. Klein P, Pawson T, Tyers M (2003) Modelarea matematică sugerează interacțiuni de cooperare între un ligand polivalent dezordonat și un singur sit al receptorului. Curr Biol 13: 1669-1678.
  23. 23. Borg M, Mittag T, Pawson T, Tyers M, Forman-Kay JD și colab. (2007) Interacțiunile polielectrostatice ale liganzilor dezordonați sugerează o bază fizică pentru ultrasensibilitate. PNAS 104: 9650-9655.
  24. 24. Mittag T, Orlicky S, Choy WY, Tang X, Lin H, și colab. (2008) Angajarea dinamică a unui ligand polivalent cu un receptor cu un singur situs. PNAS 105: 17772-17777.
  25. 25. Mittag T, Marsh J, Grishaev A, Orlicky S, Lin H, și colab. (2010) Implicații structurale / funcționale într-un complex dinamic al Sic1 dezordonat intrinsec cu subunitatea Cdc4 a ligasei ubiquitin SCF. Structura 18: 494-506.
  26. 26. Deshaies RJ, Ferrell JE (2001) Fosforilarea multisitelor și numărătoarea inversă până la faza S. Cell 107: 819-822.
  27. 27. Hill A (1910) Efectele posibile ale agregării moleculei de hemoglobină asupra curbelor sale de disociere. J Physiol 40: iv-vii.
  28. 28. Chock PB, Stadtman ER (1977) Superioritatea cascadelor enzimatice interconvertibile în reglarea metabolică: Analiza sistemelor multiciclice. PNAS 74 (7): 2766-2770.
  29. 29. Koshland DE, Goldbeter A, Stock JB (1982) Amplificarea și adaptarea în sistemele de reglementare și senzorială. Science 217: 220-225.
  30. 30. Goldbeter A, Koshland DE (1984) Ultrasensibilitate în sistemele biochimice controlate prin modificări covalente. Interplay între efectele de la zero la cele cu mai multe etape. J Biol Chem 259 (23): 14441-14447.
  31. 31. Goldbeter A, Koshland DE (1981) O sensibilitate amplificată rezultată din modificarea covalentă în sistemele biologice. PNAS 78: 6840-1981.
  32. 32. Qian H, Cooper JA (2008) Cooperativitatea temporară și amplificarea sensibilității în transducția biologică a semnalului. Biochemistry 47: 2211-2220.
  33. 33. Thron CD (1997) Comutarea biochimică bistabilă și controlul evenimentelor din ciclul celular. Oncogene 15: 317-325.
  34. 34. Bhalla US, Iyengar R (1999) Proprietăți emergente ale rețelelor căilor biologice de semnalizare. Science 283: 381-387.
  35. 35. Ferrell JE, Xiong W (2001) Bistabilitatea în semnalizarea celulară: Cum se fac procese continue procese discontinue și reversibile ireversibile. Chaos 11: 227-236.
  36. 36. Xiong W, Ferrell JE (2003) Un "modul de memorie" bazat pe feedback-ul bazat pe feedback-ul pozitiv, care guvernează o decizie privind soarta celulei. Natura 426: 460-465.
  37. 37. Brown GC, Hoek JB, Kholodenko BN (1997) De ce cascadele protein kinazei au mai mult de un nivel. Tendințe Biochem Sci 22 (8): 288.
  38. 38. Ferrell JE (1997) Cum răspunsurile devin mult mai asemănătoare cu comutarea în timp ce deplasați în jos o cascadă de protein kinază. Tendințe Biochem Sci 22 (8): 288-289.
  39. 39. Hooshangi S, Thiberge S, Weiss R (2005) Ultrasensibilitatea și propagarea zgomotului într-o cascadă transcripțională sintetică. PNAS 102: 3581-3586.
  40. 40. Gunawardena J (2005) Fosforilarea proteinei multisite face un prag bun, dar poate fi un switch slab. PNAS 102 (41): 14617-14622.
  41. 41. Salazar C, Hofer T (2003) Reglarea alosterică a factorului de transcripție NFAT1 prin situri multiple de fosforilare: o analiză matematică. JMB 327: 31-45. Salazar03.
  42. 42. Salazar C, Hofer T (2007) Reglarea versatilă a fosforilării proteinelor multisite prin ordinea procesării fosfatului și a interacțiunilor protein-proteine. FEBS J 274: 1046-1061.
  43. 43. Krishnamurthy S, Smith E, Krakauer D, Fontana W (2007) Comportamentul stochastic al unui circuit de comutare moleculară cu feedback. Biologie directă 2: 13-30.
  44. 44. Liu X, Bardwell L, Nie Q (2010) O combinație de fosforilare multisită și sechestrare a substratului produce răspunsuri asemănătoare. Biophys J 98 (8): 1396-407.
  45. 45. Kim SY, Ferrell JE (2007) Concurența substratului ca sursă de ultrasensibilitate în inactivarea Wee1. Cell 128: 1133-1145.
  46. 46. Chen KC, Csikasz-Nagy A, Gyorffy B, Val J, Novak B, și colab. (2000) Analiza cinetică a unui model molecular al ciclului celular de drojdie în devenire. Mol Biol Cell 11: 369-391.
  47. 47. Cross FR, Archambault V, Miller M, Klovstad M (2002) Testarea unui model matematic al ciclului celular de drojdie. Mol Biol Cel 13: 52-70.
  48. 48. Chen KC, Galzone L, Csikasz-Nagy A, Cross FR, Novak B, și colab. (2004) Analiza integrată a controlului ciclului celular în drojdie înfloritoare. Mol Biol Cell 15: 3841-3862.
  49. 49. Barberis M, Klipp E, Vanoni M, Alberghina L (2007) Dimensiunea celulei la inițierea fazei S: o proprietate emergentă a rețelei G1 / S. PLOS Comp Biol 3 (4): e64.
  50. 50. Liu C, Li Y, Semenov M, Han C și colab. (2002) Controlul fosforilării / degradării β- catenei printr-un mecanism cu dublă kinază. Celula 108 (6): 837-847.
  51. 51. Bean JM, Siggia ED, Cross FR (2006) Coerența și sincronizarea examenului de pornire a ciclului celular la rezoluția unei singure celule. Mol Cell 21: 3-14.
  52. 52. Jeffery DA, Springer M, King DS, fosforilarea multisită a Pho4 de către ciclin-CDK Pho80-Pho85 este o acțiune semi-procesivă cu preferința site-ului. J Mol Biol 306: 997-1010.
  53. 53. Pierce NW, Kleiger G, Shan SO, Deshaies RJ (2009) Detectarea polubiquitilation secvențială pe o perioadă de timp milisecunde. Natura 462 (7273): 615-619.
  54. 54. Marino S, Hogue IB, Ray CJ, Kirschner DE (2008) O metodologie pentru efectuarea analizei globale de incertitudine și sensibilitate în biologia sistemelor. J. Theor Biol 254 (1): 178-196.
  55. 55. Markevich NI, Hoek JB, Kholodenko BN (2004) Întreruptoare de semnalizare și bistabilitate provenite din fosforylarea multisite în cascade de protein kinază. JCB 164 (3): 353-359.
  56. 56. Benito J, Mart'n-Castellanos C, Moreno S (1998) Reglarea fazei G1 a ciclului celular prin stabilizare periodică și degradare a inhibitorului CDK p25rum1. EMBO J17 (2): 482-497.
  57. 57. Wang S, Zhang Y, Soosairajah J, Kraft AS (2007) Regulamentul RUNX1 / AML1 în timpul tranziției G2 / M. Leuk Res 31 (6): 839-851.
  58. 58. Bao MZ, Shock TR, Madhani HD (2010) Fosforilarea multisite a regulatorului de creștere filamentos S. cerevisiae Tec1 este necesară pentru recunoașterea sa prin adaptorul Cdc4 al ligandului ubiquitin E3 și distrugerea sa ulterioară in vivo . Eukaryot Cell 9 (1): 31-36.
  59. 59. Park HJ, Ding L, Dai M, Lin R, Wang H (2008) Fosforilarea multisită a Arabidopsis HFR1 de către casein kinaza II și un rol plauzibil în reglarea ratei de degradare a acestuia. J Biol Chem 283 (34): 23264-23273.
  60. 60. Nishizawa M, Kawasumi M, Fujino M, Toh-e A (1998) Este necesară o fosforilare a Sic1, un inhibitor al ciclin-dependnet kinazei (Cdk), de către Cdk incluzând Pho85 kinaza pentru degradarea promptă. Mol Biol Cell 9: 2393-2405.
  61. 61. Wysocki R, Javaheri A, Kristjansdottir K, Sha F, Kron SJ (2006) CDK Pho85 testează inhibitorul CDK Sic1 pentru a ameliora stoparea punctului de control al glicemiei după deteriorarea ADN. Nature Struct & Mol Biol 13 (10): 908-914.
  62. 62. Coccetti P, Zinzalla V, Tedeschi G, Russo GL, Fantinato S, și colab. (2006) Sic1 este fosforilat de CK2 pe Ser201 în celule de drojdie înfloritoare. Biochem Biophys Res Commun 346: 786-93.
  63. 63. Sedgwick C, Rawluk M, DeCesare J, Raithatha S, Wohlschlegel J, și colab. (2006) Saccharomyces cerevisiae Ime2 phosphorylates Sic1 locuri multiple PXS / T, dar este insuficientă pentru a declanșa degradarea Sic1. Biochem J 399: 151-160.
  64. 64. Escote X, Zapater M, Clotet J, Posas F (2004) Hog1 mediază arestarea ciclului celular în faza G1 prin țintirea duală a Sic1. Nature Biotech 6 (10): 997-1002.
  65. 65. Olsen JV, Blagoev B, Gnad F, Macek B, C Kumar, și colab. (2006) Dinamica globală, in vivo și specifică a fosforilării site-ului în rețelele de semnalizare. Cell 127: 635-648.
  66. 66. Dueber JE, Mirsky EA, Lim WA (2007) Proteine ​​de semnalizare pentru inginerie sintetică cu control de intrare / ieșire ultrasensibil. Nature Biotech 25 (6): 660-662.
  67. 67. Elsasser S, Chi Y, Yang P, Campbell JL (1999) Fosforilarea controlează temporizarea distrugerii Cdc6p: o analiză biochimică. Mol Biol Cell 10 (10): 3263-3277.
  68. 68. Lanker S, Valdivieso MH, Wittenberg C (1996) Degradarea rapidă a Cyclin G1 G1 indusă de fosforylarea dependentă de CDK. Science 271 (5255): 1597-1601.
  69. 69. Jallepalli PV, Brown GW, Muzi-Falconi M, Tien D, Kelly TJ (1997) Regulament al replicării inițiator de proteină p 65 cdc 18 de CDK fosforilare. Genele Dev 11 (21): 2767-2779.
  70. 70. Welcker M, Singer J, Loeb KR, Grim J, Bloecher A, și colab. (2003) Fosforilarea multisită prin Cdk2 și GSK3 controlează degradarea ciclinei E. Mol Cell 12: 381-392.
  71. 71. Hao B, OEHLMANN S, Sowa ME, Harper JW, Pavletich NP (2007) Structura unui Fbw7-Skp1-Ciclina E complex: recunoaștere substrat multisite-fosforilat de ligases ubiquitin SCF. Mol Cell 26: 131-143.
  72. 72. Jin J, Shirogane T, Xu L, Nalepa G, Qin J, și colab. (2003) SCF β-TRCP leagă semnalizarea Chk1 la degradarea proteinei fosfatazei Cdc25A. Genele Dev 17 (24): 3062-3074.
  73. 73. Hansen DV, Loktev AV, Ban KH, Jackson PK (2004) Plk1 reglementeaza activarea anafaza promovarea complexului de fosforilare și declanșarea SCF βTrCP distrugere a APC -dependentă inhibitor Emi1. Mol Biol Cel 15 (12): 5623-5634.
  74. 74. Chi Y, Huddleston MJ, Zhang X, Young RA, Annan RS, și colab. (2001) Reglarea negativă a factorilor de transcripție Gcn4 și Msn2 prin kinaza dependentă de ciclina Srb10. Genele Dev 15 (9): 1045-1050.
  75. 75. Hübner A, Barrett T, Flavell RA, Davis RJ (2008) Fosforilarea multisită reglează stabilitatea Bim și activitatea apoptotică. Mol Cell 30 (4): 415-425.